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1、实验五：血液凝固及其影响因素 实验人： 同组人： 【实验目的】1 学习血液凝固的基本过程2 了解加速或延缓血液凝固的一些因素【实验原理】血液凝固是一个酶的有限水解激活过程，在此过程中有多种凝血因子参与。根据凝血过程起动时激活因子来源不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性激活途径是指参与血液凝固的所有凝血因子在血浆中，外源性激活途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的激活过程。【实验材料和用具】家兔清洁小试管7个、小烧杯2个、竹签、秒表、试管架、哺乳动物手术器械一套、兔手术台、动脉夹、塑料动脉插管、线、棉花、水浴槽、冰盒液状石蜡、肝素、草
2、酸钾12mg、脑匀浆液0.1ml、生理盐水【实验过程】1、 动物麻醉及颈部手术 （此部由助教老师操作）取一只动物，称重。按1g/kg体重的剂量将乌拉坦（氨基甲酸乙酯）由耳缘静脉缓慢注入，观察动物肌张力、呼吸与角膜反射的变化。动物麻醉后背位固定于兔手术台上。剪去颈部手术野的毛，沿颈正中线在喉头上一指至锁骨上一指的地方作一57cm的皮肤切口。分离皮下组织及肌肉。2、 颈总动脉插管（此部由助教老师操作）在气管两侧辨别并分离颈总动脉，颈总动脉下方穿两条线备用。在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹，在动脉夹远心端距动脉夹约3cm处结扎。用小剪刀在结扎线的近侧（结扎线与动脉夹之间）沿向心方向剪一小斜口（约占管
3、径的一半），向心脏方向插入动脉插管，由备用的线结扎固定。取血时将动脉夹松开即可。3、 血液凝固的加速和延缓观察1. 打开兔颈总动脉夹，血液从动脉插管流出，弃去第一份1mL动脉血后，向每个试管中注入1mL兔动脉血，并摇匀。2. 自血液流出动脉插管开始计时。除第1管外，其他各管每隔15秒钟将试管倾斜一次，观察液面是否倾斜即血液是否流动，直到试管内血液不再流动为止，记录凝血时间。3. 当第2管已经凝固时，再倾斜第1管看血液是否凝固，若尚未凝固则按上述方法每隔15秒钟倾斜一次，直到血液凝固为止，记录凝血时间，即为该兔血的凝固时间。4. 以第2管为对照，各管观察其他各管中血液凝固时间。5. 向第9管中滴
4、加2氯化钙2滴，观察血液是否凝固。6. 取出第5管中的玻棒，用水洗净，观察附着在玻棒上的纤维蛋白。注意事项： / a) 取放试管时要用拇指和食指捏住试管的上端，不要握住试管的底部，以免手的温度影响结果。b) 每支试管口径及采血量要尽量一致，不可相差太大。c) 记录凝血时间要准确。d) 判断凝血的标准要前后一致。一般以倾斜试管达45时，试管内血液不见流动为准。【实验结果及相关讨论】管号实验条件凝血时间（一组）凝血时间（二组）现象解释1加入0.1肝素溶液0.1mL（6滴）大于20min大于20min肝素是抗凝剂，能不可逆的阻止血液凝固。由于肝素钠具有带强负电荷的理化特性，能干扰血凝过程的许多环节，
5、在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶（AT-）结合，而增强后者对活化的a、a、a、a和a凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。中和组织凝血活素（因子）。抑制血小板的聚集和释放。它对血中有机成分和无机成分的测定均无影响。2加入2草酸钾溶液0.1mL （6滴）大于20min血液凝固的多个环节中都需要钙离子的参与，故通常用枸橼酸钠、草酸钠和草酸钾作为体外抗凝剂，它们可与钙离子结合而除去血浆中的钙离子，从而起到抗凝作用。理论上当继续向血液中加入CaCl2溶液，CaCl2中的
6、钙离子会起到凝血因子IV的作用，从而使再次启动凝血过程，血液凝固。草酸盐是可逆性抗凝剂。但本次实验中加入CaCl2后并没有出现凝血现象，可能是CaCl2溶液配置有问题，或者由于操作不当，凝血因子已经完全失活。3室温（6滴生理盐水）静置7min30s7min30s血液流出血管后，很快会凝固。血液流出血管后血小板4室温（6滴生理盐水）每隔15S倾斜454min5min倾斜可加速血小板的粘附聚集过程，并加大血小板释放的凝血因子与血细胞的接触面积，从而加快了凝血的过程。该过程是内源性凝血过程。5细玻璃粉少许（6滴生理盐水）2min45s3min玻璃粉是异物，可激活凝血因子及血小板，启动凝血过程。6脑组
7、织浸出液（6滴）15s30s脑组织液中有组织因子途径抑制物，是外源性凝血途径的特异性抑制剂，因而能加速凝血过程。7置于40水浴（6滴生理盐水）165s165s适当升高温度，能增加酶的活性，加快凝血过程。8置于10水浴（6滴生理盐水）大于20min降低温度可以降低酶的活性，延缓凝血过程。9竹签搅拌（6滴生理盐水）有富有弹性的纤维蛋白纠缠在竹签上同上 在竹签的搅动下，特别是缠上线的接触面粗糙的竹签，能加速凝血过程，使凝血因子按一定顺序相继激活而生成凝血酶，最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白，而纠结在竹签上，形成一层蛋白膜。机体凝血系统包括凝血和抗凝两个方面，两者间的动态平衡是正常机体维持体内血液流动状态
8、和防止血液丢失的关键。机体的正常止凝血，主要依赖于完整的血管壁结构和功能，有效的血小板质量和数量，正常的血浆凝血因子活性。其中，血小板和凝血因子是生理性止凝血的重要成分,(见图1)。抗凝系统不仅包括抗凝因子，还包括纤溶系统。BT出血时间CFT束臂试验CRT血块收缩试验BPC血小板计数CT凝血时间 RT复钙时间 APTT活化部分凝血活酶时间PT凝血酶原时间PF3血小板第3因子TF组织因子Fb纤维蛋白TXA2血栓素A2 5-HT5羟色胺PK激肽释放酶原HMWK高分子量激肽原图1 正常止血机制及血栓与止血常用筛选试验检测环节血小板的作用：在正常的血液循环中，血小板并不与内皮细胞表面或其他细胞发生作用
9、，而是沿着毛细血管内壁排列，维持其完整性，血管局部受损伤时，血小板的止血兼有机械性的堵塞伤口和生物化学性粘附聚集作用。止血时，首先是受损的血管壁发生收缩，使局部血液流动变慢或减少。血液中的血小板在vWF因子存在下迅速粘附于暴露的胶原纤维，此时血小板被激活，血小板形态发生改变，由正常的圆盘状态变为圆球形，伪足突起，血小板发生聚集(血小板膜糖蛋白IIb/IIIa由纤维蛋白原介导发生互相粘附、聚集)，此为血小板第一相聚集，激活的血小板便发生释放反应和花生四烯酸代谢，其中许多物质，如血小板的ADP等，可加速血小板的聚集、变性成为不可逆的“第二相聚集”，形成白色血栓，构成了初期止血的屏障。与此同时，由血
10、小释放和激活许多促凝物质参与血液凝固反应。血小板膜磷脂表面提供了凝血反应的场所，血小板第3因子在凝血过程多个环节中发挥重要作用，血小板合成释放的TXA2和5-HT促使进一步收缩，血小板收缩蛋白则最终可使纤维蛋白收缩(血块收缩)，使血栓更为坚固，止血更加彻底。凝血过程：血液凝固简称凝血，是血液由流动状态变为凝胶状态的过程，它是止血功能的重要组成部分。凝血过程是一系列凝血因子被相继酶解激活的过程，最终生成凝血酶，形成纤维蛋白凝块。迄今为止，参与凝血的因子共有14个。其中用罗马数字编号的有12个(从，其中因子并不存在)。习惯上，前4个凝血因子常分别称为纤维蛋白原(因子)、凝血酶(因子)、组织因子(因
11、子)和钙离子(因子)。凝血因子VI已知是血清中活化的凝血因子V，故不再视为一独立的凝血因子。1内源性凝血途径内源性凝血途径是指参加的凝血因子全部来自血液(内源性)。临床上常以活化部分凝血活酶时间(APTT)来反映体内内源性凝血途径的状况。内源性凝血途径是指从因子激活，到因子X激活的过程。当血管壁发生损伤，内皮下组织暴露，带负电荷的内皮下胶原纤维与凝血因子接触，因子即与之结合，在HK和PK的参与下被活化为a。在不依赖钙离子的条件下，因子a将因子激活。在钙离子的存在下，活化的a又激活了因子。单独的a激活因子X的效力相当低，它要与a结合形成1：1的复合物，又称为因子X酶复合物。这一反应还必须有Ca2
12、+和PL共同参与。2外源性凝血途径外源性凝血途径：是指参加的凝血因子并非全部存在于血液中，还有外来的凝血因子参与止血。这一过程是从组织因子暴露于血液而启动，到因子被激活的过程。临床上以凝血酶原时间测定来反映外源性凝血途径的状况。组织因子是存在于多种细胞质膜中的一种特异性跨膜蛋白。当组织损伤后，释放该因子，在钙离子的参与下，它与因子一起形成1：1复合物。一般认为，单独的因子或组织因子均无促凝活性。但因子与组织因子结合会很快被活化的因子激活为a，从而形成a组织因子复合物，后者比a单独激活因子增强16000倍。外源性凝血所需的时间短，反应迅速。外源性凝血途径主要受组织因子途径抑制物(TFPI)调节。
13、TFPI是存在于正常人血浆及血小板和血管内皮细胞中的一种糖蛋白。它通过与因子a或因子a-组织因子-因子a结合形成复合物来抑制因子a或因子a-组织因子的活性。另外，研究表明，内源凝血和外源凝血途径可以相互活化。3凝血的共同途径从因子X被激活至纤维蛋白形成，是内源、外源凝血的共同凝血途径。主要包括凝血酶生成和纤维蛋白形成两个阶段。(1) 凝血酶的生成：即因子a、因子a在钙离子和磷脂膜的存在下组成凝血酶原复合物，即凝血活酶，将凝血酶原转变为凝血酶。(2) 纤维蛋白形成：纤维蛋白原被凝血酶酶解为纤维蛋白单体，并交联形成稳定的纤维蛋白凝块，这一过程可分为三个阶段，纤维蛋白单体的生成，纤维蛋白单体的聚合，
14、纤维蛋白的交联。纤维蛋白原含有三对多肽链，其中纤维蛋白肽A(FPA)和B(FPB)带较多负电荷，凝血酶将带负电荷多的纤维蛋白肽A和肽B水解后除去，转变成纤维蛋白单体。从纤维蛋白分子中释放出的FPA和FPB可以反映凝血酶的活化程度，因此FPA和FPB的浓度测定也可用于临床高凝状态的预测。纤维蛋白单体生成后，即以非共价键结合，形成能溶于尿素或氯醋酸中的纤维蛋白多聚体，又称为可溶性纤维蛋白。纤维蛋白生成后，可促使凝血酶对因子的激活，在a 与钙离子的参与下，相邻的纤维蛋白发生快速共价交联，形成不溶的稳定的纤维蛋白凝块。纤维蛋白与凝血酶有高亲和力，因此纤维蛋白生成后即能吸附凝血酶，这样不仅有助于局部血凝
15、块的形成，而且可以避免凝血酶向循环中扩散。在凝血共同途径中有两步重要的正反馈反应，有效地放大了内外源凝血途径的作用。一是Xa形成后，可反馈激活因子、；二是凝血酶形成后，可反馈激活因子、以及凝血酶原。凝血酶还可促使血小板发生聚集和释放反应，刺激血小板收缩蛋白引起血块退缩。但大量凝血的产生却反过来破坏因子、和因子，这是正常凝血的负反馈调节，以防止不适当的过度凝血。抗凝剂的选择：（1） 草酸钾：常用于尿素、肌酐、纤维蛋白原等测定，不能用钾、钙等测定，对LDH、丙酮酸激酶、AKP和淀粉酶有抑制作用。（2） 肝素：常用于电解质、血气分析、血氨等测定。抗凝剂比例为5061u肝素/5ml血。注意钠盐可使淀粉酶升高。（
