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1、一、脲酶测定（比色法）1、试剂配制：（1） pH6.7 柠檬酸盐溶液：取 368g 柠檬酸溶于 600mL 蒸馏水中，另取 295g 氢氧化 钾溶于水，再将两种溶液合并，用 1N 氢氧化钠将 pH 调至 6.7，并用水稀释至 2L。（2） 苯酚钠溶液：称取 62.5g 苯酚溶于少量乙醇中，加 2mL 甲醇和 18.5mL 丙酮，后 用乙醇稀释至 100mL（A 液），保存再冰箱中。称取 27g 氢氧化钠溶于 100mL 水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏 水稀释至lOOmL备用。（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9，溶液稳定。（4）10
2、%尿素溶液：10g尿素溶于lOOmL水中。（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L,则得1mL含O.lmgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2、操作步骤称取5 g土置于50mL容量瓶中，加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15min；往瓶中加入 5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液（pH6.7）,仔细混匀。在37C恒温箱中培养24 h。 然后用热至38C的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上），摇荡，将悬液过滤。取滤液1mL 置于50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液，并立即加入3mL次 氯酸钠溶液，加入每一
3、试剂后,立即将混合物摇匀,20mi n后，将混合物稀释至刻度,在波长 578 nm处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差，根据标准曲 线求出氨态氮量。标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸 馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色， 定容。1h内再分光光度计上于578nm处比色。3、结果计算以24小时后1g 土壤中NH3N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）Ure=a V n/m式中：a为由标准曲线求得的NH3N浓度（mg/mL）； V为显色液体积（50mL）； n为分
4、取倍数；m为烘干土重（g）。土壤脲酶活性测定（NH+释放量法）4脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应：H NCONH +H O 脲酶 2NH +CO22232在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等 化合物的水解。脲酶含有镍，分子量在151, 000 Da480, 00 Da之间。能够抑制脲酶活性的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50 的重金属的盐、含氟化合物、 醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。1. 试验原理通过对新鲜土壤与尿素溶液在37
5、C培养2h后测定氨释放量，估计脲酶的活性（Tabatabai,1994）。2. 试验仪器50mL容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。3. 试验试剂（所用试剂均为分析纯）a. 甲苯（C6H5CH3）;b. 缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷c （C2H8O3N3） =0.05mol L-1, pH9.0：称取6.1g三2833（羟甲基）氨基甲烷（Tris （hydroxymethyl） aminomethane）溶入 700mL 蒸馏水中，用 c（H2SO4） =0.2mol L-1的硫酸溶液调pH至9.0,再用蒸馏水定容至1000mL;c. 尿素溶液cCO（NH2）2=0.2 molL-1：称取1
6、.2g尿素溶入约80mL缓冲液中，后用该 缓冲液定容至100mL。尿素溶液要当天配制，并在4C下保存备用；d. 氯化钾硫酸银混合溶液c （KCl） =2.5molL-i p （Ag2SO4）=100mgL-i：先将 100mg Ag2SO4溶于700mL蒸馏水中，再加入188g的KCl （分析纯）使之溶解，在定容至1000mL；e. 氧化镁（MgO）：于高温电炉中，将氧化镁在600C-700C温度下灼烧2h,再放置于干 燥器中冷却，贮于瓶中；f. 混合指示剂：溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇（95%纯度） 中；g. 硼酸指示剂溶液p （H3BO3）=20gLJ：
7、溶解20g硼酸于950mL的热蒸馏水中，冷却, 加入20mL的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.1molL-1,直至 溶液呈红紫色（pH约4.5），稀释成1L；h.硫酸标准溶液c （1/2H2SO4）=0.005molL-i。4. 试验步骤将5.00g新鲜土样（2mm）放置于50mL容量瓶中，加入0.2mL甲苯（试剂a）和9mL缓 冲溶液（试剂b），轻摇混匀后加入1.0mL尿素溶液（试剂c），再次轻摇混匀并塞上瓶塞。 在37C下培养2h。然后加入约35mL的KCl-Ag2SO4溶液（试剂d）,轻摇容量瓶几秒钟后， 放置至室温（约5min）,用KCl-Ag2SO4溶
8、液定容，摇匀。同时要仪同样步骤做空白，只是 培养2h后先加35mL的KCl-Ag2SO4溶液，然后加入1.0mL尿素溶液。蒸馏法测氨：取土壤悬浮液20mL至蒸馏瓶中，加入0.2g的MgO,用硼酸指示溶液吸收， 蒸馏液的体积约为30mL。用c （1/2H2SO4）=0.005 moLL-i的H2SO4标准溶液滴定。5. 结果计算（N ）=C 八 X ts X 14 x 1000m x k x 2式中：e （N）单位时间内氨态氮的释放量，mgkg-山-1； c 1/2H2SO4标准溶液的浓度，moLL-1；VH2SO4标准溶液的体积，mL；ts分取系数，2.5；14氮的摩尔质量，mg mmol-1
9、；2培养时间， 2h；m样品质量，g；k水分系数。6. 注意：a. 与其他缓冲液（如磷酸盐缓冲液）相比，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液优点在于它能 够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH，因为后者能够 促进脲酶的活性；b. 在配制KCl-Ag2SO4溶液时，应将KCl溶于溶解后的Ag2SO4溶液中，因为Ag2SO4在 KCl溶液中不溶。加入KCl-Ag2SO4混合溶液后脲酶的活性停止，因此该悬浮液在测定氨之 前可以放置 2h。方法来源：鲁如坤. 土壤农业化学分析方法. 北京: 中国农业科技出版社, 2000.二. 过氧化氢酶测定(容量法)1. 分析意义过氧化氢酶广泛存在
10、于土壤中和生物体内。土壤过氧化氢酶促过氧化氢的分解有利于防 止它对生物体的毒害作用。过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关，与微生物数量也有关 一般认为，土壤中催化过氧化氢分解的活性，有 30或 40以上是耐热的，即非生物活性， 常由锰、铁引起催化作用。土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性成正比例。2. 试验原理Kappen (1913)首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活性。此 法根据过氧化氢与土壤相互作用时，未分解的过氧化氢的数量用容量法(常用高锰酸钾滴定 未分解的过氧化氢)测定过氧化氢酶活性。反应方程式如下：2KMnO +5H O +3H SO 2MnSO +K SO +
11、8H O+5O4 2 2 2 4 4 2 4 2 23. 试剂配制a. 0.3%过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释b. 3N 硫酸；c. 0.1N高锰酸钾(1/5KMnO4)溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。4. 操作步骤( 1) 取 2g 风干土，置于 100mL 三角瓶中，并注入 40mL 蒸馏水和 5mL 0.3%过氧化 氢溶液。(2) 同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液，而不 加土样。(3) 将三角瓶放在振荡机上振荡20min。而后加入5mL 3N硫酸，以稳定未分解的过 氧化氢。再将瓶
12、中悬液用慢速滤纸过滤。然后，吸取25mL滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至 淡粉红色终点。5. 结果计算用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B,用于滴定25mL原始的过氧化 氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。(A-B) XT即为过氧化氢酶活性。以20min后1g 土壤的0.1N高锰酸钾的毫升数表示。 式中 T 为高锰酸钾滴定度的校正值。方法来源：关松荫. 土壤酶及其研究法. 北京: 农业出版社, 1986.高锰酸钾溶液的配制与标定1、配制称取3.3g高锰酸钾，溶于1050ml水中，缓缓煮沸15min,冷却后置于暗处保存2周。 以4号玻璃滤埚过滤于干燥的棕色瓶中。过滤高锰酸钾溶液所
13、用的玻璃滤埚预先应以同样的高锰酸钾溶液缓缓煮沸5min。收集瓶 也应用此高锰酸钾溶液洗涤23 次。2、标定称取0.2g于105110C烘至恒重的基准草酸钠，称准至0.0001g。溶于100ml (8+92) 硫酸溶液中，用配制好的高锰酸钾溶液c (KMn04) =0.1mol/l滴定，近终点时加热至6 5C,继续滴定至溶液呈粉红色保持30s，同时作空白试验。3、计算高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算c(1/5KMn04) =m/(V1-V2) *0.06700式中 c(1/5KMn04) =高锰酸钾标准液之物质的量浓度， mol/l；m草酸钠之质量，g；V1 高锰酸钾溶液之用量， ml；V2空白试
14、验用高锰酸钾溶液之用量，ml；0.06700与 1.00ml 高锰酸钾溶液 c(1/5KMn04) =1.000mol/l 相当的以克表示的草酸 钠的质量。KMnO4标准溶液的标定准确称取0.150.2g预先干燥过的Na2C2O4，力口 80mL水，20mL 3molL-i的H2SO4使其溶 解，用水浴慢慢加热至有蒸汽冒出(约343358K),趁热用待标定的KMnO4溶液进行滴定。 开始宜慢，在第一滴KMnO4溶液滴入后，不要搅动溶液，当紫红色褪去后再滴入第二滴。 待溶液中有Mn2+产生后，反应速度加快，滴定速度可适当加快，但不能使KMnO4溶液呈线 状流下。近终点时，紫红色褪去很慢，应减慢滴
15、定速度并充分搅拌，以防超过终点。最后滴 加半滴KMnO4溶液，搅匀后，微红色半分钟不褪，表明已到终点，计算KMnO4的浓度三、蔗糖酶测定（比色法）：1、试剂配制（1）3, 5二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水 中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL （不超过7天）。（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12电0溶于1L蒸馏水中） 0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5mL即成。（3）8%蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中（ 4 ）甲苯（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80C烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水 中，即成标准葡萄糖溶液（5mg还原糖/mL）再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液 （0.5mg/mL）。2、操作步骤称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL 8%蔗糖溶液，5mL pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL,注入50mL容量瓶中，加
