甲酰肽受体2多效调控巨噬细胞分化与肿瘤发生

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1、甲酰肽受体-2 (FPR-2)多效调控巨噬细胞分化与肿瘤发生一、背景资料：1、甲酰肽受体-2 (FPR-2)2、ROS-MARK-NF-kB 信号通路3、NF-kB二、全文翻译摘要 癌细 胞能 产生 丰富的化 学引 诱物 和生 长因子， 比如 巨噬细胞 集落刺激 因子 (M-CSF/CSF-1)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1/CCL2)。这些因子和引诱物会招募单核细 胞、巨噬细胞和其它炎性细胞来促进肿瘤的生长发展。基于对这个机制的了解我们知道，靶 向肿瘤细胞和调控肿瘤微环境在设计抗肿瘤治疗方案时非常重要。在这里，我们的研究显示 出，不论是否注射了脂多糖(LPS)，血清淀粉样蛋白一A (S

2、AA)和抗菌肽(LL-37)都会 刺激M-CSF和MCP-1表达；相反，脂氧素-A4 (LXA4)和膜联蛋白-A1 (ANXA1)也会 通过人(HepG2)和鼠(H22)肝癌细胞(HCCs)来抑制LPS-诱导的M-CSF和MCP-1的 产生。然而，相同的是LXA4、ANXA1、SAA和LL-37效应的产生均依赖于它们细胞表面 共同的受体甲酰肽受体-2 (FPR-2)和随后的ROS-MAPK-NF-kB信号通路。另外，我 们的研究结果显示LPS可以使巨噬细胞向IL-10低表达、IL-12高表达的M1型转化，而 M-CSF+MCP-1和FPR2激动剂可以使巨噬细胞向IL-10高表达、IL-12低表

3、达的M2型转化。 在那方面，虽然调节信号转导与转录激活因子3 (STAT3)、LXA4和ANXA1的磷酸化作用 可以诱导巨噬细胞向M2a型、M2c型分化并显示出抗肿瘤发生的活性。然而，SAA、LL-37 和M-CSF+MCP-1可以导致细胞向M2b型、M2d型分化加重体内外实验中HCC的侵犯现 象。我们的研究发现，FPR2在肿瘤免疫编辑中发挥着可观的多效调控作用。关键词 甲酰肽受体-2 巨噬细胞集落刺激因子 单核细胞趋化蛋白-1 巨噬细胞 肿瘤发 生1 介绍一个多世纪以前，Virchow基于肿瘤组织中存在白细胞而假定炎症和肿瘤有某种联系。 从那时以来，大量的流行病学研究和实验都支持了这一观点。

4、在许多条件下，肿瘤发生发展 在很大程度上受控于炎症。较新的研究证据也表明损坏消除炎症的内生机制可以导致慢性炎 症并促进肿瘤生长。巨噬细胞是肿瘤免疫编辑中的关键因素。巨噬细胞可以分为两种亚型，M1型和M2型。 这种分类方法是基于它们对于IL-10、IL-12的表达量不同。M1型有着有效地杀菌性并促进 Th1响应，而M2型则支持与Th2相关的效应。M2型进一步可以分为M2a、M2b、M2c、 M2d四种。M2a、M2b型巨噬细胞发挥免疫调节功能、驱动Th2响应；而M2c在抑制免疫 反应和促进组织重构方面起决定性作用；M2d 型,也叫做肿瘤相关巨噬细胞TAMs，它在肿 瘤驱动信号，如 M-CSF/C

5、SF-1、 MCP-1/CCL2 的作用下在肿瘤部位累积，它可以在肿瘤耐 受方面起积极作用，也会损害抗肿瘤免疫治疗的疗效。甲酰肽受体-2(FPR2,也被称为甲酰肽样受体-1或脂氧素A4受体ALX)，是G蛋白偶 联受体(GPCRs)中化学引诱物受体亚族中的一员。它有复杂的功能性质，部分原因是它的 高杂交性，部分原因是激活该受体后，根据其不同起源和高度结构多样性的配体可以或刺激 或抑制炎症反应。另外，由于FPR2在炎症中的重要作用，FPR2也不可避免的被牵连到癌 症中。阐明FPR2在肿瘤发生中的确切机制是很重要的，它能使我们更好地理解炎症与肿瘤 病理生理，并使我们设计出更加有效地抗肿瘤治疗策略。在

6、我们的研究中，我们在人（HepG2）和鼠（H22）肝癌细胞（HCCs）的M-CSF和 MCP-1表达水平上观察了四种结构不同的FPR2激动剂的作用：LXA4、SAA、ANXA1和 LL-37。此外，这些结果均向我们提供了一个全新的角度来研究FPR2在肿瘤免疫编辑中可 能的调节机制。我们还发现这些激动剂能明显的使巨噬细胞向M2型转化，并在体内外显示 出在 HCC 肿瘤发生上出现相反的作用。2 结论FPR2激动剂对HCCs上产生M-CSF和MCP-1的作用如图1所示，在HepG2和H22细胞中，M-SCF、MCP-1的mRNA和蛋白表达水平都 由于SAA、LL-37而显著增加。然而，给予LXA4和

7、ANXA1后M-CSF和MCP-1没有显著 改变。另外，与空白相比，内毒素脂多糖（LPSs）显著增加了 M-CSF和MCP-1的mRNA 及蛋白表达水平，而 LXA4 和 ANXA1 逆转了 LPS 影响 M-CSF 和 MCP-1 表达的作用。有 趣的是，SAA和LL-37增加了 LPS诱导的M-CSF和MCP-1的累积（图S1）。这些结果表 明不同的FPR2激动剂可以在HCCs的M-CSF和MCP-1累积中起到相反的作用。FPR2激动剂对M-CSF和MCP-1表达水平的调控作用部分归因于NF-kB的活化和表达众多周知，转录因子核因子-kB（NF-kB）在炎症和消除炎症过程中起重要作用。我们

8、 同意上述结论。在用SAA、LL-37或者LPS处理的HepG2细胞中，我们观察到NF-kB p50 表达有所增加。相反，LXA4和ANXA1能够减少NF-kB p50的表达。LXA4逆转LPS诱导 的NF-kB p50的增加（图2a，上方）。同样的，用SAA、LL-37或LPS处理后，NF-kB的结 合活性也显著增加，而给LXA4或ANXA1后观察不到明显改变。SAA能够提高，而LXA4 能够完全的抑制LPS诱导的NF-kB的转录活性（图2a,下方）。另外，用RNA干扰使NF-kB p50基因沉默会抑制NF-kB的结合活性，也会部分削弱 SAA诱导的M-CSF和MCP-1生成，而对LXA4处

9、理的M-CSF和MCP-1表达无效（图2b 和2c）。这表明NF-kB参与FPR2调节的M-CSF和MCP-1的生成过程。注： beta-actin 是内参抗体ROS和MAPKs参与FPR2对M-CSF和MCP-1累积的调节作用我们知道很多物质激活NF-kB是通过ROS和/或MAPKs调控的，于是我们想是否FPR2 激动剂的作用也是通过ROS和/或MAPK信号通路实现的呢？如图3a中所显示的，当单独 暴露给LPS、SAA和LL-37以后，ROS的水平增加。单独暴露给LXA4和ANXA1后，没 有改变ROS的水平，但LXA4能使LPS诱导增加的ROS下降。磷酸化的ERK （pERK）在 暴露给S

10、AA和LL-37后显著增加。SAA还可以诱导磷酸化的p38 （pp38）活化，而LL-37 对pp38没有作用。相反，LXA4和ANXA1都会抑制ERK和p38磷酸化（图3b）为了判断在FPR2-NF-kB-M-CSF/MCP-1信号轴中ROS在处于MAPK的上游还是下游， 我们使用DPI（ROS生成抑制剂）、PD98059（pERK特异性抑制剂）还有SB203580 （pp38 抑制剂）如图3c、3d所示，抑制ROS和MAPks使NF-kB p50和SAA诱导产生的M-SC F、MCP-1的表达下降。值得注意的是，DPI减弱了 ROS的生成和SAA诱导的pERK及p p38的表达水平。而MA

11、PK的抑制剂PD98059和SB203580不能使得ROS下降。这表明R OS是位于MAPKs的上游的。同样有趣的是，在给LXA4后，不论PD98059、SB203580还 是 DPI 都没能明显的改变 ROS 和 MAPKs 的水平。这些实验结果都表明 FPR2 能够通过 RO S-MAPKs-NF-kB信号通路双向调节M-CSF/MCP-1的水平。注：2,7 dichlorofluorescin diacetate. 2,7-二氯荧光素二乙酸酯Arbitrary units 任意单位SAA和LXA4对M-CSF/MCP-1的累积调控作用依赖于FPR2如图4a、4b所示，相比于杂小发卡RNA

12、群，SAA上调M-CSF和MCP-1的作用明显 的在FPR2沉默后（FPR2小发卡RNA）群受到阻碍。在用FPR2小发夹RNA转染HepG2细 胞后，LXA4也不能抑制LPS诱导的M-CSF和MCP-1的表达。SAA和LXA4也都分别通过激活Toll样受体（TLRs）和白三烯-B4受体（BLT1）来发 挥作用。在我们的研究中，E5564（TLR抑制剂）和U-75302（BLT1拮抗剂）分别抑制与1 25I-SAA和3H-LXA4的结合（图4c、4d）。E5564和U-75302 1卩M的剂量就足以分别抑制 其与125I-SAA和3H-LXA4的结合。同样有趣的是，在用E5564 1 u M刺激

13、30分钟后，我 们加入未标记的SAA,结果SAA逆转了与125I-SAA的进一步结合（图4c）。同样的，在加 入U-75302后，LXA4也能逆转与3H-LXA4的结合（4d）。接下来我们发现，未标记的SA A以浓度依赖性方式竞争结合125I-SAA； LXA4不影响125I-SAA的结合活性，而是取代其与 3H-LXA4的结合。SAA也不能逆转与3H-LXA4的结合（图4e、4f）。这些实验证明LXA4 和SAA激活FPR2通过结合到HepG2细胞的不同位点上，并因此在调节M-CSF、MCP-1 表达水平上起到相反的作用。FPR2激动剂对巨噬细胞分化的作用毫无疑问，调节TAM表型应该是一种抑

14、制肿瘤进展的有效治疗策略。巨噬细胞相关细 胞株U937已经在很多体外实验中作为TAMs的代替物。在这里，我们通过在体外给以上几种 激动剂来检测U937巨噬细胞的分化情况。如图5a中所示的，与对照组相比，LPS抑制IL-10 并刺激IL-12p35生成，这是M1型的表征，然而M-CSF+MCP-1和F PR2激动剂使得U937细胞 高表达IL-10低表达IL-12p35，即M2型表征。百日咳毒素（PTX ）会阻碍这些改变，这表明 所有这些激动剂刺激巨噬细胞分化是通过激活G蛋白偶联受体（GPCR）实现的。另外，我 们发现F PR2拮抗剂WRW4损害LXA4/ANXA1和SAA/LL-37对于诱导I

15、L-10和IL-12p35的作用 （图5a）。这些结果都表明LXA4/ANXA1和SAA/LL-37通过激活细胞膜上的FPR2来使巨噬细 胞向M2型转化。接着又产生一个疑问那就是FPR2激动剂和M-CSF+MCP-1会诱导出哪种亚型的细胞？ IL-12p40是IL-23的亚型，其他异二聚体细胞因子有着和IL-12不同的生物学效应。IL-23在应 对感染和癌症发展的炎症反应中很重要。在我们的研究中，IL-23p19表达可以被LPS、 M-CSF+MCP-1、SAA和LL-37增加，而不受LXA4或ANXA1 的影响（图5b）。在一系列动物模型上都很显著的促癌活性的炎性细胞因子有：IL-6、IL-

16、1beta和 TNFalpha。这些因子中任何一个都有可能作为治疗的靶点。在我们的研究中，这些因子的 表达水平也都被LPS、M-CSF+MCP-1和SAA上调。相比对照，LL-37增加IL-6和IL-1beta的表 达，而不影响TNFalpha蛋白积累。IL-23p19, IL-6和IL-1b在对照组、LXA4组和ANXA1组相 同。但TNFalpha被LXA4和ANXA1抑制（图5b）。这些结果都表明SAA和LL-37促癌。我们 的发现也提出了一种可能，即LXA4和ANXA 1抑制肿瘤生成是通过减弱肿瘤微环境中巨噬细 胞的IL-6、IL-1bata和TNFalpha表达。CCL17、CCL1、CXCL13和CXCL8（IL-8）生成分别与M2a、M2b、M2c和M2d单核细胞 激活有关。并且是先天免疫和获得性免疫中单核巨噬细胞介导的调节轴中很重要的一部分 如图5c所示，给M-CSF+MCP-1、LXA4和ANXA1后，CCL17水平明显增加