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1、代谢组学技术流程:卑f 荷担代审網#一、GC-MS代谢组学【实验方案】检测平台：Agilent7890/5975?气-质联用仪操作步骤（以血清为例）：取100此 血清于1.5mL EP管，加入75丄内标（氯苯丙氨酸，0.1mg/mL）, 再加入800丄甲醇和100 pL去离子水。将溶液充分混旋使血清中蛋白析出，在室温下超声5min。在12000rpm的转速下离心10min，分离蛋白。取800 pL上清液于4mL气相进样瓶中，在氮气下将溶液完全吹干。再加 入100 pL硅烷化衍生试剂（BSTFA与乙酸乙酯体积比为1:1的混合溶液），90 C下反应1h。冷却至室温后， 取1 pL进入GC/MS分析
2、。【数据分析方案】1. 数据预处理以内标做参照，通过使用自主研发的专利软件，对质谱峰进行对齐，得岀校正后的数据;2. 差异分析p阈值，判断p值小于阈值的化用统计学方法，计算每种化合物在不同样品组中差异的显著性，设置 合物为检测含量有显著差异的化合物；3. 聚类分析用聚类方法对差异结果进行同源聚类，通过聚类图展示各样本间的关系:#4. PCA 分析(principal component analysis )通过对有显著性差异的化合物数据做PCA分析，将样品的特征量压缩，在低维度空间反映样品之间的关系。用score plot 展示PCA分析结果。5. ROC诊断分析ROC曲线(receiver
3、operating characteristic curve)又称受试者工作特征曲线该方法广泛用于医学诊断性能的评价， 将灵敏度设为纵轴，特异性设在横轴，该曲线下的积分面积大 小与诊断试验的优劣密切相关：二、LC-MS代谢组学【实验方案】检测平台： Waters ACQUITY? UPLC 系统操作步骤(以尿液为例)：在室温下对冻存的尿液样 本进行解冻，然后添加 2倍4C去离子水稀释，蜗旋混合后过0.22微米滤膜，对所得滤液进行液质分析。进样量为5微升，样本运行按照随机顺序进行。【数据分析方案】1.数据预处理对原始数据进行提取，对齐，归一化分析, 通过原始基峰离子(BPI)色谱图，初步观察仪器
4、 的保留时间重现性，所测得的物质数量，以及 不同组之间的色谱图是否具有较明显的差异。2.聚类分析用聚类方法对差异结果进行同源聚类，通过 聚类图展示各样本间的关系，并观察组间的分离 关系。3. PCA 分析(principal component analysis )iHiiaaaaaiiiiHaaa”一上田通过对有显著性差异的化合物数据做PCA分析，将样品的特征量压缩，在低维度空间反映样品之间的关系。在正式多维统计 前,先对所有归一化的数据进行平均中心化和Pareto-scaling预处E -QD -M -3D -20 -HD 町 141 2D 30 4D 5D SD TO#1H NMR图理，
5、用score plot 展示PCA分析结果4. PLS-DA 分析一种用偏最小二乘法回归作为核心算法的分类计算方法，其 最终结果返回的是回归因子，根据其返回结果进行类别判断。我 们能根据PLS-DA对所建模型的对外预测能力进行评价。5. 差异化合物筛选根据PLS-DA模型的VIP值大于1，且的p值小于0.05的原则获得差异性物质，如下表所示:均值对数比中值对数比保留时间(min)质荷比p value (ttest)(B/A)(B/A)0.67203.05223.69ET01.6161.7514.24447.09230.0026771.3451.9347.51373.27360.0019790.
6、5670.7440.71114.06550.000230.5820.648几个代表性物质的Box plot如下所示：#1H NMR图#1H NMR图6. 差异化合物鉴定我们搜索Metlin数据库(Mass tolerance 0.1 Da )，获得一些可能的物质信息。目前对液质分析获得的化合物的定性方法还主要依靠与标准品的比对来判定，因此定性工作将面临巨 大的挑战。我公司可对化合物进行进一步定性，如有需要可联系公司相关区域销售代表。三、NMR代谢组学【实验方案】检测平台：NMR Varian lnova600MHz?(配置超低温探头) / NMR Bruker A VANCE II 600MH
7、z?。操作步骤(以血清为例)：样品预处理所有血清解冻后在4 C、12000g离心10min。取0.4 mL上层血清加至5mm NMR测试管中，再加入0.1mL重水振荡混匀。进行 NMR测试，记录血清样本1H NMR谱，实验温度 为25C，预饱和法压制水峰，饱和时间为2 s。采用Carr-Purcell Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列抑制血清中较宽的蛋白质信号。采用 2.1 s的弛豫延迟时间、8000.0 Hz的谱宽和1.000 s的采集时间。总回波时间100 ms， 累加次数128次。【数据分析方案】1. 1H NMR 图对谱图进行傅立叶变换，相位调整，基线 校正、去偏置等处理，
8、结合化合物归属表及相 关数据库，鉴定实验所检测到的代谢产物。3. PCA分析为了分析各个样品之间的关系，将校正后的数据做PCA分析（。PCA是可以将分散在n维变量上的代谢指纹图谱信息集中到某几个综合指标（主成分）上的统计分析方法。#1H NMR图#1H NMR图PCAscores plot4. 组间差异代谢物统计对组间变化显著的代谢产物进行统计分析，计算相关系数。实例如下表所示:Metabolitesa rPBS-LCbPBS-C LC-CGlucose: 3.19(ddc), 3.34(t), 3.40(m), 3.43(t), 3.84(dd),4.48(d)0.867 0.852-0.9
9、19Valine: 0.91(d), 0.98(d)-0.844-0.770NAG: N-acetyl glycoprotein signals: 1.98(s)-0.712 0.867组间差异代谢物列表PBS-LCt15. PLS-DA 析在分析得到差异代谢物的基础上，用偏最小二乘法 -判别分 析（PLS-DA识别的算法寻找一组代谢物作为生物标志物，建立 最优的判别模型，使达到最好的区分疾病和正常样品的效果。PLS-DA分析图6. OPLS-DA 分析对PLS-DA模型进行正交矫正处理（OPLS-DA，使用SIMCA软件进行正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异。OPLS-DA使用自适换算（unit variance scaling）的数据标度换算方式。#PBSLC4020-20-40-40-2002040Chamtcal Shift (ppm|loadingplotst1P2 2R2X=67.7%, Q2=0.676OPL S-DA分析图7.器官内部和不同器官之间显著变化代谢物之间的关联分析计算器官内部及不同器官之间显著变化代谢物之间的相关系数，利用matlab构建像素图。关联分析像素图it#
