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1、新生儿重症联合免疫缺陷病的筛查重症联合免疫缺陷病(Severe Combined Immunodeficiency , SCID )是一种婴儿致命性的紊乱，这种病常常在出生后好几周才有明 显的临床症状。 SCID 可通过造血干细胞移植( hematopoietic cell transplantation，HCT )得到有效的治疗，并有强有力的证据表明在 无症状期进行早期干预可获得较好的结果和提高生存。以前，仅仅是 有SCID家族史的婴儿才在出生时就进行检测。以家庭为基础的调查显 示出生时进行检测的婴儿存活为 85%而出生时未进行检测的新生儿存 活率为58%。2001年，从临床上积累的经验和证
2、据使SCID被确定为 NBS公共卫生的目标。2005年，Chan和Puck发表了一种使用实时 定量 PCR( Quantitative Polymerase Chain Reaction qPCR)检测 NBS中TREC含量的方法来发现SCID。2008年，Wisconsin开始在 实验室使用实时 qPCR 检测 TREC 进行第一次基于人群的前瞻性的 SCID NBS初步研究。2009年，Massachusetts采用内部控制多通路 实时q PCR TREC试验进行SCID NBS预试验项目。从此美国和全球其 他NBS项目已经将SCID引入到它们的常规筛查中，并且更多的NBS 项目正在努力获
3、得实施。1. 重症联合免疫缺陷病的生物学重症联合免疫缺陷病(Severe Combined Immunodeficiency， SCID )指的是一群主要以T细胞发育和功能严重损伤为特征的疾病。 SCID新生儿筛查(newborn screening，NBS )可用于鉴别患SCID 和其他紊乱造成的严重的 T 淋巴细胞减少症的新生儿。任何相关的基 因缺陷可能导致SCID和其他T细胞减少症导致的紊乱。2. SCID的生物学和临床特征SCID 的典型临床表型以早期的极度易感性为特征的免疫缺陷。根 据不同基因突变将导致不同表型和淋巴细胞缺陷。虽然许多单基因缺 陷与SCID有关，诊断主要还是取决于严重
4、的T淋巴细胞减少和T细胞 功能紊乱。治疗的目标是防止感染和最终实现免疫重建和恢复正常的 细胞和体液免疫。2.1原发性免疫缺陷病概述原发性免疫缺陷病（ Primary immunodeficiency disorders ，PIDD ）形成接近200种具有各种各样临床表型和疾病严重程度的先天 性疾病群。许多PIDD已知与单基因缺陷有关，但还有些PIDD仍然不 知道或可能由单基因或多基因导致。重要的是，PIDD从临床上区别与 其他继发性免疫缺陷。通常根据免疫学机制和由根本缺陷导致的临床 表现将 PIDD 进行分类。虽然一半以上的 PIDD 都属于抗体不足，但 TREC试验主要适用情况是SCID。虽
5、然所有SCID的发病率估计在 1:50000至1:100000之间，但根据经验，来自NBS项目的数据是低 估的。随着科技的进步和对原发性免疫缺陷病的了解，许多其他PIDD 可能会在未来被发现。2.2 SCID 病程新生儿SCID通常出生时表现为健康。整个身体出现红斑鳞状皮疹 可能是最早的SCID的表现之一。因感染或吸收不良，许多婴儿发展为 顽固/慢性腹泻,导致体重增加障碍（发育停滞）。出现症状的中位年龄 是8周；3个月之前，大多数婴儿将经历严重的感染。患SCID的婴儿 容易感染细菌（如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌），病毒（如巨细胞病 毒、单纯疱疹）和真菌（如念珠菌属）。他们尤其容易机会性感染 （如
6、 卡式肺，隐孢子虫）。感染是复发性的，并可危及生命。此外，婴儿接 种减毒活疫苗（如轮状病毒、卡介苗、麻疹、腮腺炎、风疹、水痘） 后可能患严重的传染性疾病。由于母亲 T 细胞移植或输入没有经过去 白细胞或辐照的血制品后，严重 T 细胞减少患儿可能产生移植物抗宿 主病。2.3 SCID/重症T淋巴细胞减少症的遗传特征重症联合免疫缺陷病包含一组以 T 细胞缺少为特征，因不同分子 缺陷而导致的联合免疫缺陷疾病。大部分免疫学家认为至少有14 种基 因缺陷与SCID典型的表型相关。大部分SCID基因缺陷是单基因常染 色体隐性遗传，除外一种X性联缺陷（编码IL2共同y链的IL2RG突 变）。除了幼稚T细胞的
7、缺少，基于B细胞和自然杀伤细胞（natural killer，NK）（TBNK 分类），大部分 SCID 基因型具有清楚表述的免疫 表型。3. 定量PCR检测概述这部分包括讨论 TREC 试验应用的理论和对此方法目前应用于SCID NBS的描述。其中还包括DBS参考物质（NBS-RMs ），检验 前、检验中和检验后质量保证（quality assuranee , QA）要素，以及 简要强调SCID NBS项目应该监测的实验室和人群数据。3.1 定量PCR检测干血斑点中TREC的类型两种类型定量 PCR （ Quantitative Polymerase Chain Reaetion , qPC
8、R）（实时qPCR和单点qPCR）通常用于定量靶序列。它们均依 赖于 PCR 特异性扩增 DNA 靶序列和主要用荧光标记进行校准，但它 们不是一个用于常规筛查的高通量的方法。最常见的qPCR类型是实时PCR,实时PCR通过荧光信号记录 PCR 反应的每个循环。指数期内荧光信号到达阈值的扩增周期（量化 周期Cq）分数作为仪器读数。目前，实时qPCR被所有SCID NBS项 目所采用，它是唯一一种附有SCID新生儿检测临床确认文件的分析形 式。大部分实时qPCR仪器都适用于这种检测，包括384孔板，它允 许在一次循环中分析更多的样品。第二种类型的 qPCR 基于预定时间点或扩增周期的单一荧光谱检
9、测。扩增是在最优的扩增周期中进行，扩增之后对反应信号减小检测。 扩增数目由这一次荧光读书决定。这种类型的检测有时被称为“单 点” qPCR或“终点” qPCR。目前，终点qPCR法检测DBS中TREC 正在发展中，但这种方法还没有在基于 NBS 人群的初步研究中应用和 确认。这两种类型的qPCR都可用于检测DNA序列的相对数目或绝对拷 贝数。绝对拷贝数的检测需要与校准物比较，后者具有相应拷贝数浓 度的独立的分配值。第三种qPCR类型是数字PCR，这种PCR最近已由商业化仪器开 发。原则上，数字 PCR 提供绝对目标序列拷贝数而不要参考独立的标 准。数字PCR用于检测DBS样品中TREC正在开发
10、。3.2采用实时qPCR试验检测新生儿干血斑点中TREC用于SCID NBS的TREC试验必须能够区别DNA模板缺乏或非常 低拷贝数的样品与只有较低拷贝数DNA模板的正常样品。新生儿DBS 样品收集的变异性增加了鉴别异常TREC水平的难度。由于TREC试验 是基于PCR扩增DNA，所以一些可能影响反应的因素包括：不适当的 样品；不能从 DBS 中将足够的 DNA 洗涤下来；或存在肝素之类的PCR 抑制剂。为了保证较低的 TREC 结果不是人为因素导致(造成假 阳性筛查结果)，SCID NBS应该包含对参考基因中保守序列的扩增试 验。目前SCID NBS试验使用核糖核苷酸酶P ( RNaseP
11、)或肌动蛋 白基因序列。3.3 定量 TREC拷贝数校准材料使用校准曲线来决定 TREC 拷贝数，其中校准曲线是通过稀释含TREC序列的质粒或TREC序列转染的细胞系绘制的。3.4 DBS分析质量控制的参考物由于DBS标本的独特属性，应该使用DBS参考物质时常监测、评 估和审核NBS定量试验。DBS参考物质也是用于开发和确认实验室 NBS检测方法的重要工具。在方法开发和常规质量控制方面，DBS参 考物质都提供了校准参数之外的方法性能的次级评价。来自SCID或T细胞缺陷征确证新生儿的剩余DBS是非常有价值 的实验室参考物质，这些参考物质应该储存于尽可能好的储存条件下， 并被节约用于实验室内或之间
12、的特殊评估。这部分将讨论替代DBS参 考物质的使用。这些参考物质可能由 NBS 实验室制备或来源于外部机 构。目前，TREC试验的DBS参考物质的主要外部来源是美国CDC。3.4.1用于质量控制的DBS参考物质的制备DBS参考物质被用于分析质量控制(quality control ,QC),以 评价DBS TREC试验在正确鉴别后面三种类型样品的性能：TREC处于 新生儿期望范围内的样品；TREC低于新生儿期望范围的样品；基因组 DNA不能扩增证明其TREC结果不确定的样品。每种类型的样品需要不同制备的替代材料。为了提供长期QC和实 验室间评价足够的材料，需要能够提供大量同质 DBS 的生产方
13、法。 CDC已经开发出了这种方法，并已在一些NBS实验室实施。341.1具有一定水平的TREC DBS质控物模拟新生儿期望范围 代表新生儿期望范围的 DBS 参考物质最好用脐带血制备，因为外 周血中TREC随着年龄增长而减少，而老年人中TREC则是微乎其微。由不同TREC水平的脐带血样品制备的不同批号DBS参考物质将评估 期望范围内的分析性能。具有较低水平TREC的DBS参考物质对于评 估分析性能尤其有用。341.2具有一定水平的TREC DBS质控物模拟重型联合免疫缺陷 病阳性对照应该代表SCID类似样品，即不含或含很少TREC，但具 有正常的内标基因水平。来源于老年人血(通常大于50岁)的
14、DBS样 品常常是合适的SCID阳性对照，但必须证实每个捐赠单元，当用DBS 检测时，不包含或很少TREC。可通过密度梯度离心去除T细胞和其他 单核细胞从而进一步去除捐赠血中TREC，但随着捐赠者年龄增长，此 种分离变得不那么有效。去除成人血中单核细胞可使基因组DNA水平 降低至低于正常新生儿血液中DNA期望范围。一种更有选择性去除新 鲜血液中T细胞的技术，如免疫磁珠，对于超过8小时的血样品，其T 细胞去除效果将不那么好。341.3 DBS质控物证明扩增失败用于反应由于 DNA 量不足或检测方法中的问题导致无法扩增的 DBS参考物质应该包含在分析中QC中。这些既含有TREC，其内标基 因含量又
15、低于新生儿期望范围的参考物质，可以来源于去白细胞的成 人血。3.4.2分类指定值的一致性评估用于分析中 QC 的 DBS 参考物质应该在多个实验室进行评估，以 建立分类指定值的一致性。CDC制备的DBS参考物质被用于多个实验 室的模拟性能力评估调查(Model Proficiency Evaluation Survey， MPES )。一旦要求，CDC也可能会评估NBS项目生产的DBS材料， 这些材料也可能会被其他NBS实验室评估。3.4.3储存DBS参考物质的适当储存将确保储存过的样品的可靠性。DBS应 该储存在含干燥剂和湿度指示剂的较少气体的透水带中。当多个 DBS 储存在相同的容器中时，
16、应该用实验室称重纸或半透明纸隔开，以防 止可能的交叉污染。虽然正式的稳定性研究还有待此指南的发表，但 CDC MPES的结果表明DBS中的TREC至少能够储存在4弋-20弋含 干燥剂的环境下24个月。3.5 质量控制要素3.5.1 分析前质量控制NBS实验室的NBS分析前QC包括血斑点收集、运输、处理和标 本评估。综合性的处理请参见CLSI文件LA04。3.5.2 分析中质量控制分析中QC也叫实验室内QC，是实验室执行的一套用于持续评估 实验室工作和检测，以决定结果报告是否足够可信。分析中 QC 的主 要目标是为了确保检测或观察结果的临床准确性和天与天之间的一致 性。当针对TREC检测的分析中QC涉及用于其他新生儿DBS半定量 试验相同的方法时，其对DNA污染的关注程度更高。通过PCR实现 每个样品中TREC DNA的指数式扩增，其扩增产物是原TREC的百万 倍。因为 SCID NBS
