生理学实验设计

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1、生理实验设计实验课题:筒箭毒对神经一肌肉接头处得兴奋传递得影响实验成员:星期五下午第四实验室第二组筒箭毒对神经一肌肉接头处兴奋传递得影响实验假设筒箭毒能与乙酰胆碱竞争神经肌接头处得nm受体,使肌肉松弛。实验原理与目得神经肌肉接头处得兴奋传递过程有三个重要得环节：一就是钙离子促进神经轴突中得囊泡膜与接头前膜发生融合而破裂二就是囊泡中得乙酰胆碱释放到神经肌肉接头间隙；三就是乙酰胆碱与接头后膜上得受体结合引发终板电位。乙酰胆碱(A c etyl c holine,ACh)就是一种重要得神经递质,就是连接每个运动神经元与骨骼肌 之间得信使。如果ACh得传递受阻，肌肉就不能收缩。箭毒就是美印第安人在猎箭

2、头部涂抹 得一种毒药，它能够占用并阻塞ACh受体得位置,能竞争性阻断ACh得去极化作用致使神 经递质不能影响肌肉、能与ACh竞争神经肌接头处得nm胆碱能受体，但不激动受体,因而使 骨骼肌松弛、抗胆碱酯酶药可拮抗其肌肉松弛作用，新斯得明就是胆碱酯酶抑制剂，可通过抑 制胆碱酯酶增减乙酰胆碱在肌接头间隙得浓度。故筒箭毒过量可用适量新斯得明解救。筒箭 毒与乙酰胆碱竞争性结合乙酰胆碱受体，注射新斯得明后使突触间隙内得乙酰胆碱浓度升高 而使竞争性增强,故乙酰胆碱与受体接触增多，从而使肌无力症状减弱。本实验得目得就是探索筒箭毒对神经-一肌接头处兴奋传递得影响极其相关机制;观察筒箭 毒得肌松作用，分析其作用点

3、;了解新斯得明对抗筒箭毒得作用。实验对象大白鼠，体重2 5 0g以上实验器材与药品Powerla b 一套（主机，刺激器，张力换能器）,手术器械一套，小动物人工呼吸机，气管插管,棉线, 大头针，铁架台,注射器0. 0 0 1 g%筒箭毒碱,0。005g%新斯得明,2 5%乌拉坦,1。5%普鲁 卡因，生理盐水实验方法1、大鼠称重，麻醉;25%乌拉坦腹腔注射0 5ml/100g麻醉。然后仰卧固定于鼠手术床 上，分离气管及颈外静脉，分别插入气管插管与静脉插管，准备好人工呼吸机。数分钟后翻正反 射消失，即可进行实验；2、分离坐骨神经;在髋关节后,坐骨结节内凹陷处切开皮肤，钝性分离肌肉,暴露一段坐骨神经

4、, 用浸有1、5%普鲁卡因得棉线围绕坐骨神经打一个结，在坐骨神经干上做传导阻滞麻醉，排除 下行干扰；3、分离腓神经;在外侧剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，分离腓神经，神经穿线备用；4、 分离胫前肌;将大鼠两前肢固定在手术台（仰卧），从后置踝关节正前方向剪开小腿皮肤， 剪断踝关节前部韧带，分离胫前肌肌腱，沿胫骨分离胫前肌（注意不要损伤血管）,在踝部得胫前 肌肌腱处扎线，与结扎线远端切断肌腱；5、安装并设定pow e rlab记录肌张力得chart设定文件;调定刺肉毒碱对神经肌肉接头处 处兴奋传递得影响6、连接仪器;手术操作完成后，将胫前肌与p。werlab得张力换能器向连接，腓神经处安放刺 激电极。

5、最适负荷设定为10g左右。稳定一段时间后,于给药前记录一段正常得肌肉收缩 曲线；7、缓慢静脉注射0。001%筒箭毒碱0.1ml/10 0 g,从仪器上观察肌肉收缩曲线得变化情况；8、待肌肉收缩曲线再次稳定或完全消失后，停止刺激，同时缓慢静脉注射0。005%新斯得明 0、1 5m 1/ 1 0 0g,观察肌肉收缩曲线得变化情况、预期结果注射筒箭毒后肌肉收缩曲线幅度变小甚至消先即肌肉处于肌无力状态，注射新斯得明后肌肉 收缩曲线又基本恢复正常,即肌肉恢复正常收缩状态；结果分析从神经传来得兴奋,通过神经一肌肉接头传递给肌纤维膜,就是以化学递质乙酰胆碱为中介进 行得,其全过程可分为:（1）接头前过程、（

6、2）神经递质在间隙得扩散。（3）接头后过程、如果就是筒箭毒作用于突触前膜,即不能释放乙酰胆碱，那么无论就是否有新斯得明,后膜中 均无乙酰胆碱，所以在注射新斯得明后仍然就是肌无力状态即不会出现预期结果；如果就是筒箭毒作用于突触间隙,即与突触前膜释放得乙酰胆碱结合，抑制其发挥作用，那么 无论就是否有新斯得明,后膜中均无可发挥肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响作 用得乙酰胆碱，所以在注射新斯得明后仍然就是肌无力状态即不会出现预期结果；而如果就是筒箭毒作用于突触后膜，即与乙酰胆碱竞争性结合乙酰胆碱受体，注射新斯得明后 使突触间隙内得乙酰胆碱浓度升高而使其竞争性增强,使乙酰胆碱与受体接触增多，从而使

7、肌 无力症状减弱，使肌肉收缩曲线幅度增强，即会出现预期结果；综上所述，假设成立。注意事项1。在静脉注射筒箭毒与新斯得明时推射速度不宜过快,以免引起动物呼吸麻痹而导致其死 亡，影响实验结果;当其呼吸停止时立即进行人工呼吸；2。分离神经时只能用玻璃分针，不可用金属器械或手触摸；3。分离神经时切勿伤及神经干及其分支避免过度牵拉与其她不良刺激。实验流程图/.开始 一大鼠称重呷卒，连接人工呼吸机分离坐骨神经 rx一日 匕. I数分钟后,翻正反射消失分离腓神经顷 在坐骨神经干上做传导阻滞麻醉分离I胫前肌R1神经穿线备用安装仪器调定参数_ C/连件器 、静脉注射筒箭毒碱广、I T肌肉收缩曲线稳定或消失后静脉

8、注射新斯得明停止刺激预测实验结果 x相关资料得出结论验证假设1神经肌肉接头处得结构在神经末梢中含有大量直径约5 0 nm得囊泡，称为接头小泡，一个 囊泡内约含有1万个乙酰胆碱分子。骨骼肌得神经一肌肉接头就是由接头前膜、接头间隙、 接头后膜(运动终板)三部分组成。接头前膜就是运动神经末梢嵌入肌细胞膜得部位，因此，接 头前膜就是神经轴突得细胞膜;接头后膜，又称终板膜，就是与接头前膜相对应得肌细胞膜。它 较一般得细胞膜厚，并有规律地向细胞内凹陷，形成很多皱褶，增加与接头前膜得接触,有利于 兴奋得传递。在接头后膜上有与ACh特异结合得N 2型乙酰胆碱受体,它们集中分布与皱褶 开口处，就是化学门控通道得

9、一部分，属于阳离子通道耦联受体。在终板膜表面还分布有胆碱 酯酶,它可将ACh分解为胆碱与乙酸;接头前膜与后膜之间并不直接接触，而就是被充满了细 胞外液得接头间隙隔开,间隔约50nm,其中尚含成分不明得基质。2神经肌肉接头处得兴奋传递过程从神经传来得兴奋，通过神经一肌肉接头传递给肌纤维膜，就是以化学递质乙酰胆碱为中介进 行得,其全过程可分为：(1 )接头前过程.(2)神经递质在间隙得扩散.(3 )接头后过程。2、1接头前过程肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响 2、1. 1乙酰胆碱得合成与贮存这就是神经-肌肉接头得兴奋传递得前提、乙酰胆碱在神经末梢中由胆碱与乙酰辅酶A在胆 碱乙酰化酶得作用下合

10、成得。乙酰辅酶A主要来自神经末梢内得线粒体，胆碱则就是靠膜上 得特殊载体转运到神经末梢内得，其中50%就是释放入接头间隙中得乙酰胆碱水解产物被 再摄取回来重复利用得。合成与摄取回来得乙酰胆碱均以囊泡形式包装贮存，以备释放。2。1。2乙酰胆碱得释放 Ca2+内流就是诱发乙酰胆碱释放得必要环节、当动作电位到达 神经末梢时，接头前膜得去极化使电压门控Ca2 +通道开放，大量C a 2+由胞外进入到突触前 末梢内，这些C a2+不仅就是一种电荷携带者,可抵消神经末梢内得负电位，而且本身就就是一 种信使物质，可以触发囊泡中得乙酰胆碱以胞吐得形式释放到接头间隙中。一次动作电位引 起得Ca2+内流,可导致2

11、00300个囊泡几乎同步地完全释放出乙酰胆碱分子。由于每个囊 泡中所含得乙酰胆碱分子数相等，约5 000-10000个，故这种以囊泡为单位得倾囊释放，被称 为量子释放。如果降低细胞外C a 2+ 浓度或用M g2 +阻断C a 2+内流，动作电位到达时 并不能引起乙酰胆碱释放，说明Ca2+在前膜得兴奋与乙酰胆碱递质释放过程中起偶联与 触发作用、这里Ca2+得进入量也决定囊泡释放得数量。2、2乙酰胆碱在接头间隙得扩散乙酰胆碱在接头间隙后,经扩散与终板膜上得胆碱能受体特异性结合触发接头后过程。肉毒 碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响2、3接头后过程2.3。1乙酰胆碱受体及终板电位 在终板膜上得N型

12、乙酰胆碱受体，就是集受体与通道为一 体得一个蛋白大分子结构。当乙酰胆碱分子与受体结合后,使受体一通道分子构象改变，通道 开放，允许N a +、K+甚至少量得Ca2+通过、由于这几种离子在细胞内外分布特点故主要就 是使Na+内流，少量K+外流，结果就是终板膜原有静息电位负值减少，向零电位靠近即出现终 板膜得去极化，终板膜这种去极化电位为终板电位。一次动作电位所引起到200300个囊泡 释放得乙酰胆碱，足以在终板膜上产生约60m V.持续12ms得终板电位。而每一个囊泡释 放得乙酰胆碱所引起得终板膜0、11 mV得去极化电位，称微终板电位。2。3、2乙酰胆碱从接头间隙得清除 乙酰胆碱发挥作用后可通

13、过3方式清除,即扩散、酶 降解与再摄取、由于多个囊泡几乎就是同步释放乙酰胆碱至接头间隙，乙酰胆碱得浓度突然 升高，乙酰胆碱与受体结合可引起大量化学门控通道打开,出现很快Na +、K+跨膜移动，故终 板电位升高很快。但接头间隙中得乙酰胆碱很快被突触后膜上得胆碱酯酶水解，乙酰胆碱浓 度降低，递质门控通道关闭，终板电位下降，保证下次到来得神经冲动效应，被水解得产物被动 地再摄取到轴突末梢，可作为再合成乙酰胆碱得原料。2。3.3终板电位得特征及肌膜动作电位得引起 终板电位属于局部电位，具有局部电位得 特征,即没有“全或无现象，其电位得大小与乙酰胆碱释放量成正相关;呈电紧张性扩布，约在 距终板膜2nm处

14、基肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响 基本消失;无不应期,有总与现象等、一般记录到终板电位就就是众多微终电位得总与。由于 在终板膜以外得肌膜上有电压门控Na+、K+通道得分布，当终板电位扩布到邻近得肌膜上，引 起邻近肌膜去极化达阈电位水平时，便爆发肌膜上得动作电位，表现为肌细胞得兴奋。正常情 况下，一次动作电位传至运动神经末梢所释放得乙酰胆碱所引起得终板电位刺激邻近肌细胞 膜，其刺激强度大约超过引起肌细胞动作电位所需阈值地3-4倍,故有很高得安全系数，即运 动神经每一次神经冲动到达末梢，都能可靠地使肌细胞兴奋而诱发一次收缩。3神经肌肉接头处得兴奋传递特征：3.1化学性传递。神经一骨骼肌接头

15、处得兴奋传递就是通过神经末梢释放ACh这种化学传 递进行得。3、2单向性传递、兴奋只能由运动神经末梢传向肌肉，不能作相反方向得传递。这就是由神 经-骨骼肌接头处得结构特点决定得。3、3时间延搁。兴奋通过一个神经一骨骼肌接头一般至少需要0.5 1。0ms,而接头间隙只 不过50nm。3、4易受药物或其她环境因素得影响。细胞外液得碱度、温度得改变与药物或其她体液性 物质得作用等都可以影响神经一骨骼肌接头处得兴奋传递、4神经肌肉接头处得兴奋传递影响因素肉毒碱对神经肌肉接头处处兴奋传递得影响4. ICa 2+Ca2+就是兴奋一分泌偶联物质，在一定离子浓度范围内,ACh得释放随着Ca2+浓度得增高而 增

16、多、Mg 2 +可拮抗C a 2+得作用，使ACh得释放量减少。4、2箭毒 箭毒能与终板上得AC h受体结合，形成无活性得a一箭毒复合物，而这种复合 物就是不能完全与ACh相结合得。因为箭毒与ACh争夺受体，所以箭毒引起得阻滞为竞争性 阻滞或非除极性阻滞、它得阻滞作用可用抗胆碱酯酶物质来缓解。重症肌无力患者得某些横 纹肌非常容易疲劳，并产生暂时瘫痪、重症肌无力传递阻、得原因,可能就是由于终板膜上AC h受体比正常少。抗胆碱酯酶药物能迅速改善患者得肌力。4、3抗胆碱酯酶药物 抗胆碱酯酶药物，如毒扁豆碱、新斯得明等，可与AChE相结合，使A ChE失去作用而不能分解ACh、有机磷农药及一些神经毒剂能抑制