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1、粪便涂片法检查菌群失调标准操作规程一、革兰染色液的配制（科氏改良法）共5种液体，分为结晶紫A液，结晶紫B液，革兰碘液，脱色液，复染液。染液名称配制方法1结晶紫A液结晶紫0.25g（研磨后），加乙醇（2ml，95%），再蒸馏水98ml2结晶紫B液Na2CO3 1.25g，加蒸馏水100ml3革兰碘液NaOH 0.1g溶于2.0ml蒸馏水中，加I2 2.0g ， KI 4.0g，再加蒸馏水至100ml4脱色液丙酮30ml+乙醇70ml（95%）5复染液沙黄2.5g3.0g加入乙醇（95%）10ml，溶解后加入蒸馏水100ml（或用10%石炭酸复红液10稀释即可）二、涂片制作1、取样：粪便标本送检时
2、，观察标本性状，并“多位点”挑取或沾取粪便标本；2、推片与固定：以3040度角推片，面积11.52cm，自然干燥后，酒精灯上火焰上能过3次固定（制作涂片2张，其中作为一张备用）；3、染色：第一步，先加A液淹没标本，再加“等量”B液混合，染色1分钟；水轻柔冲洗掉；第二步，加革兰碘液，12分钟；水轻柔冲洗掉；第三步，加脱色液20秒到30秒，根据情况而定，如涂片稍薄时就适当减少染色时间；水轻柔冲洗掉；第四步，最后复染30秒，冲洗后晾干或吸干。4、涂片制作注意要点：1、涂片不可太厚，亦不可太薄，太厚则细菌总数增加，且影响观察，太薄则涂片所见细菌总数减少，厚薄如血膜为宜。2、注意把握染色时间，好的染色是
3、能够清晰准确观察的必要条件。三、镜下观察1、确定涂片和染色情况：涂片要均匀，菌体不变形，革兰阳性和革兰阴性反差要好。2、总览细菌总数：观察总数的多少，以及有无优势菌或真菌等。其评定标准见肠道粪便检查图谱。3、观察G+杆菌、G+球菌、G-杆菌、G-球菌比例：选定有代表性的视野，计数并判定其大概比例（有经验者可根据经验判定）。计数方法可选用纸片打孔缩小视野计数法来计数；亦可选定有代表性视野，数一定数量的细菌，再计数各种比例。四、结果判定:请按照下表进行参照填写每个患者的菌群失调化验单（四联活菌肠溶胶囊临床试验专业）正 常 参 考 值 评 定 参 考 标 准分 析结 果（检验师填写） I 度失调度失
4、调 度失调大便性状正常成形或成型软便正常成形或不成形软便、稀便多数为程度不等的稀便，也可为粘液便、水样便、脓血便或柏油样便多数为程度不等的稀便，也可为粘液便，常呈黄绿色或黑色涂片所见细菌总数 5005000/油镜视野（计数5个油镜视野细菌数的均值） 细菌总数在正常范围（5015000/HP）、正常低值或略有减少（101500/HP）细菌总数明显减少（11100/HP）或无明显改变细菌总数呈显著减少（10HP）革兰阳性杆菌50.2%-74%革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球=50-74：35-44：2-10：0.5-5正常范围低值革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球=50：
5、45-50：13-30：5-10明显减少革兰阳性杆：革兰阴性杆：革兰阳性球：革兰阴性球=35-40：50：30：10细菌总数呈显著减少，粪便中原来的菌群大部分成员被抑制而消失革兰阴性杆菌35.29%-44%多数会稍有增加革兰阳性球菌2%-10%正常范围高值或增多革兰阴性球菌0.5-5% 杆菌：球菌 3:1（杆菌革兰阳性杆菌革兰阴性杆菌）（球菌革兰阳性球菌革兰阴性球菌） 1:12:1可能会出现比例倒置镜下印象：1. 肠道菌群未见明显异常 2. I度菌群失调改变 3. II度菌群失调改变 4. 度菌群失调改变五、其它说明：1、尽量用新鲜粪便进行检测，时间半小时之内，如果耽搁时间较长，可以取稍微量多的粪便样本，取样时挑取中心位置的粪便。2、遇粘液便，胨样便或水样便亦可采用牙签进涂片。3、镜检时，应将涂片视野全面观览，不可只看几个视野就计数或报告，以防误差。六、参考文献：张秀荣. 肠道菌群粪便涂片检查图谱M.北京：人民军医出版社，2000.1-25.制作：杭州龙达新科生物制药有限公司研发部日期：2008年4月
