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1、外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30100nm的双层膜黄泡状结构 小体，可由机体多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、 神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹 水、羊水等体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、 miRNAs等生物活性物质，在体参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等 生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能， 使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也 可以作为治疗手段，未来有可能作为药物
2、的天然载体用于临床治疗。外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究 至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方 法实现外泌体的提取分离：1、超速离心法（差速离心）超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心.髙速离心交替进行（如图所 示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广 受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关）,纯度也受到质 疑；此外.重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。ojllure suoematawiiuid300 x g, 10 nun严1刪ceQs
3、2000X5, lOrrinpolim = toad ceissupomciiantlO.GOOXg, 30 fftinpollct = cdl dotcissupernatantlOO.Wxg 70minpellet b xasomes conjaminating proteinsWRshln PBS I 100.000 x g. 70 minpell 改=exesomes2、密度梯度离心在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分 离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1. 13-1. 19g/ml的密度围富集。此法 获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时
4、。3、超滤离心由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对 分子质量（MWCO）的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单 高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。4、磁珠免疫法 外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)15用包被抗标记物抗体的磁珠与 外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作 简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度 影响，不利于下游实验，难以广泛普及。5、PEG-base 沉淀法聚乙二醇(PEG)可与疏水性蛋白和脂质分子结合共
5、沉淀，早先应用于从血淸等样本中 收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利 用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗 粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外 泌体等，因此发表文章时易受质疑。6、试剂盒提取近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过 滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用 化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换 代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法
6、并推广开来。有些试剂 盒操作简便，不用超速离心，同时可获得髙纯度和髙回收率的外泌体一一如lOlbio开 发的系列试剂盒,可分别针对尿液、血液、细胞上清液等多种样品进行提取7并 可进一步从外泌体中获得想要的蛋白质或者RNA分子，方便快速，因而受到大多数人 的欢迎，并发表了不少高质量的文章！然而，市场上各类产品纯化效果良莠不齐，目前仍没有绝对的方法或试剂盒能满足所 有要求，从各类样品中分离到理想的外泌体。参考文献：1 卢婉，人强，王伶.外泌体的研究进展J.生命的化学，2013, 04期(04).2 Taixue An et al. Exosomes serve as tumour markers
7、for personalized diagnostics owing to their important role in cancer metastasisJ Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4： 27522.- dx. doi. org/10. 3402/jev. v4. 27522.3 Richard J. Lobb et al. Optimized exosoine isolation protocol for cell culture supernatant and human plasmaJ Journal of Extracellu
8、lar Vesicles 2015. 4： 2703L- dx. doi. org/10. 3402/jev. v4. 27031.4 胡国文，青，牛鑫等.族转超滤：一种提取细胞外泌体的新方法J.第二军医大学 学报,2014, 35(6)： 598-602.5 Zhang et al. Exosomes in cancer： small particle, big playerJ Journal of Hematology & Oncology, 2015, 8：83. doi：10. 1186/sl3045-015-0181-x.6 Korbelik M et al. Ceramide an
9、d Sphingosine-1-Phosphate/Sphingosine act as Photodynamic Therapy-Elicited Damage-Associated Molecular Patterns： Release from Cells and Impact on Tumor-Associated Macrophages Jsnal Bioanal Tech. SI：009. doi： 10. 4172/2155-9872.SI-009.7 Chen L. , Chen R, Brigstock D. MicroRNA profiling of circulatin g exosomes during experimental liver fibrosisHepalology. AASLD abst ract, 2014 Oct (Presidential Honored Distinct Abstract)
