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1、北京鸭微卫星标记多重 PCR 体系的建立杨方喜(北京南口北京鸭育种中心 北京 102202)摘要：利用筛选出的标记了 2种荧光标记的18对北京鸭微卫星引物，再结合ABI3100遗传 分析仪电泳测序的方法,通过引物组合和优化反应条件,建立了可用于北京鸭遗传分析的多 重PCR反应体系。18个微卫星标记共获得6个具有理想扩增效果的三重PCR组合。将扩增 产物按照标记荧光的不同进一步合并为 3 组，用 ABI 3100 遗传分析仪进行高通量的电泳检 测。实验结果表明， 18 个微卫星标记可以用三重 PCR 进行快速的扩增，为北京鸭应用微卫 星标记进行分子育种奠定了基础。关键词： 北京鸭；微卫星标记；多
2、重 PCR多重PCR(Multiplex PCR)又称复合PCR,它是在同一PCR体系内用多对引物对同一模板 同时进行扩增，一次反应就可以获得多个基因产物，之后一次电泳即可检测到多个基因的基 因型。该技术具有方便、快捷、节约等优点，已被成功地应用于生命科学研究的许多领域。目前北京鸭育种主要是用常规的选育方法，但随着北京鸭DNA标记的开发，特别是新 一代遗传标记微卫星DNA的开发，以其共显性、检测方便等特点，已初步应用于预测配套 系的杂种优势、标记与生产性状的关联、群体的遗传结构和关系的分析、保种效果的评估、 亲缘关系的确定等方面，给北京鸭的育种带来了新的技术，加快了育种的进度。在检测微卫 星标
3、记的过程中，为了减轻实验室工作量，降低实验成本、加速实验进程，可以利用多重 PCR方法对微卫星标记进行扩增，这项技术在多个物种中都有报道1, 2但是在北京鸭中还 没有具体相关文献报道。本文通过对北京鸭微卫星标记多重PCR引物进行组合优化，旨在获得可用于北京鸭遗 传分析研究的稳定PCR体系，为进一步利用微卫星标记进行北京鸭育种奠定了基础。1 材料与方法1.1 实验血样北京鸭的血样采集自北京南口北京鸭育种中心的原种北京鸭群体。1.2基因组DNA的准备传统酚-氯仿法抽提DNA，在提取过程中要尽量去除血样中的蛋白成分。分光光度计检测 DNA的质量和浓度，然后确定各DNA样品的稀释倍数。取少量原液分装，
4、并稀释到50 ng/yL， 4 C冰箱保存备用，其余的-20 C保存。1.3 微卫星标记的选择 从黄银花3开发的北京鸭微卫星标记中，选择18个多态性息含量和杂合度均在中等以上 的微卫星标记，然后进行单重的梯度PCR扩增，确定每个标记的最佳退火温度和扩增产物的 片段大小范围，以及每个微卫星标记的等位基因型片段大小。1.4 引物组合按多重PCR的原则对18对微卫星引物进行组合：（1）所有位点必须同时得到扩增，即所有 引物对的复性温度必须相近；（2）在同一反应体系中，引物对之间不能有相互作用（即出现 配对现象，形成引物寡聚体）；（3）同种荧光染料标记的不同位点，其扩增片段不能相互重叠， 为了扩增产物
5、能够在琼脂糖凝胶上检测出来，片段大小必须相差50bp以上。为了满足以上原则，首先给复性温度相近的引物归为一组，然后用MPprimer软件4对 这一组的引物进行分析，排除有明显的引物寡聚体的组合引物，再按照不同片段大小进行组 合。最终组合成6组三重PCR引物，每组是由3对引物组成。1.5三重PCR体系的优化1.5.1 引物浓度的优化按常规的引物合成方法合成每一对引物，每对引物的正向引物上游5端标记H EX或6-FAM荧光染料，合成量标准是4OD,分装成4管，每管1OD。按照合成说明书，加入一定 量的双蒸水稀释成最终浓度10uM,然后室温过夜。每个组合的三对引物按1:1:1的比例吸取, 重新放在另
6、一个15m 1的离心管里混合均匀。按表1的反应体系和表2的反应程序进行多重 PCR，然后用琼脂糖检测，根据胶图上条带的亮度，调整引物浓度。三重PCR的引物总体积 控制在0.9ul。表 1 三重 PCR 反应体系试剂体积DNA1.0 u110 X Tag 酶反应 buffer1.5 u1混合引物（10uM ）0.9 u1dNTP mix（ 10mM ）0.9 u1Tag 酶（2.5U/ul）0.4 u1ddH2O10.3 ul总计15.0ul表 2 三重 PCR 反应程序步骤温度时间Step195 C5minStep295 C30sStep360C40sSfep472 C45Step5Go to
7、 step2Step672C10minStep715C10min2 结果与分析2.1三重PCR体系的建立经过多次引物重新组合、引物浓度的配比和反应条件的摸索，最后成功构建成6组扩增效果理想的三重PCR组合。各引物信息和配比浓度见下表3.表 3. 三重 PCR 引物组合组名退火温度荧光标记标记CAUD044引物 体积 0.36ul片段 范围 135-152正向引物GAAAGAATGAGTTAAAAAGGCA反向引物TGAGGCTTAATTGGTGGACASet160C6-FAMCAUD0390.36ul196-208GGGACATCTCTTGGAGCAAAAGTGAAAGCTGCTGCTGGAT
8、CAUD0490.18ul232-270TTAGTAAACTCTTGCCATCTTGTAGTTTAGTTGCTGGATACAUD0110.25ul121-140TGCTATCCACCCAATAAGTGCAAAGTTAGCTGGTATCTGCSet260CHEXCAUD0040.25ul199-221TCCACTTGGTAGACCTTGAGTGGGATTCAGTGAGAAGCCTCAUD0500.40ul287-321GGACAAGTGGCATGTGTCATGGCTTCTGTGCTCCTCAGATCAUD0760.27ul96-127CTGGAACAAGGAATTAGAAGTTATGTGGTGC
9、TGGGCTGTTSet360CHEXCAUD0910.36ul170-186GAAAAAGGCAGCACAGCACGCAAAGTTGAGGCATGTAATCCAUD0350.27ul221-237GTGCCTAACCCTGATGGATGCTTATCAGATGGGGCTCGGACAUD0810.3ul85-105CCACAGTTACAAGGAAGAGTTTCAGTGGTCTTTCGAGCTTSet462C6-FAMCAUD1190.3ul169-195TCCCTCGGCAACATCTCTGTTAAGTTCCCTAGCGAGACGCAUD0050.3ul250-284CTGGGTTTGGTGGA
10、GCATAATACTGGCTGCTTCATTGCTGCAUD0830.3ul107-117GCTGCCTGGAATATAACCGCGCATTTGCAGAGTCAGGACCSet562C6-FAMCAUD0260.3ul140-150ACGTCACATCACCCCACAGCTTTGCCTCTGGTGAGGTTCCAUD1130.3ul211-246TGACCTCCCTGACGTTTGCGTCTGCGTGTCCGTGTATGCAUD0670.3ul113-138GATGTGTCTTTTCCAGGTGCGCATCCCATCTTCAAAGCAGSet657CHEXCAUD0890.3ul167-179
11、GCAATAAAGGCTGGAGCAATATCCTCTCCCTCGCATCAUD0570.3ul264-292AACAGATGAAAGGGAGACTCATGACCTGTAGTGGATGAAG2.2 琼脂糖胶检测每个样取5ul的PCR产物，混合好上样缓冲液，点在琼脂糖胶的孔里面，然后在135V的电 压下电泳30分钟。图1显示的是set5和set6组的三重PCR产物的条带，从胶图上可以看出两个 组的条带比较清晰，三条带可以很好的分开，没有杂带。Set 5Set 6图1第5和6组引物的三重PCR产物琼脂糖胶检测结果图2.3多重PCR产物的毛细管电泳检测结果经过琼脂糖胶初步检查的三重PCR产物，再送公
12、司用ABI 3100进行毛细管电泳。电泳时, 可以将标记6-FAM和HEX的两个三重组合进行混合，就可以实现在一个泳道上检测6个微卫星标记。毛细管胶图的峰图质量好，可以用于微卫星标记的判型。图2显示的是set 4的标记 了 6-FAM蓝色荧光标记的三个微卫星标记在两个北京鸭个体中的基因型，例如CAUD081在 第一个个体的等位基因片段大小为86 bp、106bp，第二个个体的等位基因片段大小为86 bp、91bp。081406080100119|00S.|T20 140 160 180 :200 220 ;240 260 280 300由于选用引物时就考虑过片段长度不重叠、退火温度和反应循环次
13、数相同或相近等因 素，而且某些标记也是在一些研究中验证过的5, 6， 容易扩增的微卫星标记，故减少了本次 实验中多重PCR优化组合的工作量。组合优化的过程中，为了避免不必要的浪费，首先要做 琼脂糖电泳检测，只有看到条带的才上ABI 310 0遗传分析仪检测。另外，为防止在多重PCR 产物的基因分型中某些位点的信号峰过高或过低，要根据第一次多重PCR的电泳图象，适当 增减每种引物的添加量，即将每一组的所有引物在同一 PCR中共同扩增随后根据电泳图象、 基因分型数据进行调整：(1)如果几个微卫星的曲线形状正常、高度相同或相近，表明实验 成功，可以进行批量测定。 (2)如果几个微卫星的曲线形状正常、
14、但高度上有差异，只需要调整引物的添加量再次进行实验。调整原则为将曲线高度最高的微卫星引物添加量减少，将曲线高度最低的微卫星引物添加量增加，直至最佳的曲线高度出现为止。3.2多重PCR产物的自动化检测电泳是各种标记进行检测的基础，为了满足研究的需要，许多公司相继推出了一系列的 DNA序列分析仪，推动了电泳技术的发展。而将多重PCR与全自动电泳技术结合，实验技 术具有简单、快速、分辨率高等优点。用荧光标记修饰微卫星引物，然后利用ABI 3100遗传分析仪检测PCR产物，得到微卫星 标记片段长度峰图，然后使用GeneMarker1.7软件分析数据，同时进行泳道校正、同一标准 分子量内标校正和片段大小测量，增加了基因型数据的准确度。GeneMarker1.7软件进行基 因型数字化判读准确而高效，能防止各种人为因素造成的误差。由于PCR扩增过程中的不确 定因素，电泳峰谱经常会出现一些“噪音”峰，计算机在综合分析过程中会去掉这些峰，防 止了聚丙烯酰胺凝胶电泳上读带时由于“影子带”而导致的误差，较好地保证了实验结果的 准确性和精确度。经过多重PCR条件的优化，本实验优化出6组微卫星PCR引物，每组包括3对引物。这 样只要做6次三重PCR，就可得到18个微卫星标记的基因型，促进了微卫星标记在北京鸭育 种中的应用。参考文献1 孟祥军，朱庆，张明亚,et al.丝羽乌骨
