十六、乙型脑炎检测方法

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1、十六、乙型脑炎检测方法猪乙型脑炎乳胶凝集试验（LAT ）诊断试剂盒使用说明书猪乙型脑炎是由流行性日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的猪的一种繁殖障碍 性疾病。此病引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪睾丸肿胀，萎缩、丧失 配种能力及新生仔猪痉挛死亡。临床上该病多呈散发，流行常发生于蚊虫滋生的 炎热季节，患畜病初体温升高、精神沉郁、跛行、有神经症状，病愈后隐性带 毒，种猪表现繁殖障碍，该病给养猪业带来较大的经济损失。猪乙型脑炎乳胶凝集试验是用乙脑弱毒疫苗毒株经纯化、浓缩等程序后致敏 乳胶，制成乳胶凝集试验用抗原，用于检测动物血清中的乙脑病毒抗体，可在现 场进行，具有安全、简便、快速、特异、敏感之优点

2、。1试剂盒的内容：本品包括猪乙型脑炎致敏乳胶抗原、阳性血清、阴性血清、稀释液、玻片、 吸头及使用说明书。2制品用途：用于猪乙脑血清学诊断。3使用方法：31 定性试验：取待检样品（血清）、阳性血清、阴性血清、稀释液各一滴（约 15 微升左右）， 分别置于玻片上，再各加乳胶抗原一滴，用牙签混匀，搅拌并摇动12 分钟，于 35 分钟内观察结果。32 定量试验：先将血清作连续稀释，各取 1 滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照同 上，随后再各加乳胶抗原一滴，如上搅拌并摇动，判定。4 结果判定：41 对照试验：出现如下结果试验方可成立，否则应重试：阳性血清加抗原呈“+”；阴 性血清加抗原呈“”；抗原加

3、稀释液呈“”。42 判定标准：“+”全部乳胶凝聚，颗粒聚于液滴边缘，液体完全透明；“+” 大部分乳胶凝集，颗粒明显，液体稍混浊；“+” 约 50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊；“+” 有少许凝集，液体呈混浊；“” 液滴呈原有的均匀乳状。 以出现“+”以上凝集为阳性。5. 贮藏:在2-8C冷暗处保存，有效期暂定1年。6.附注：被检样品采集及处理方法。61 血清：按常规方法分离血清，要求无腐败。62 使用前应轻轻摇匀乳胶抗原。猪乙型脑炎血凝抑制试验操作方法（吴 斌）一） 实验血清处理1非特异性抑制素除净法：取 0.1 毫升血清（未稀释）加 0.9 毫升 12.5%高岭 土（或白陶土）溶液，混合

4、后放室温中 20 分钟，然后以约 2500 转/分钟离 心 1520 秒，上清液即为 1:10 的血清。2非特异性凝集的除净法：经高岭土（或白陶土）处理好的血清，加入 30%（6.4盐水配）鸽或鹅血球0.1毫升；中间振荡混合23次，在37C或4C过夜，然后1500 转/分离心 10分钟，上清液即可作 HI 试验血清。（二）配制4个单位血凝素，按血凝素滴定结果配制，血凝素单位滴度测定： 1 取已处理之清洁干燥微量料板。2. 手持吸入pH9.0盐水之微量吸管直立滴入各孔中，每孔1滴为0.025毫 升。3. 用稀释棒蘸取 0.025 毫升血凝素于第一孔中，（也可用微量吸管取 0.025 毫升血凝素加

5、入第一孔中），再用稀释棒作倍比稀释，棒在每孔中要直立旋 转 3050 次，使血凝素充分混匀，出孔时勿碰孔壁。9.0 盐水(ml) 血 清(1:10ml)12340.025 、0.0250.0250.0250.025* 0.0250.02平0.025弃血凝集0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025电 0.02目 10.025、0.025血球对照0.5(4单位ml)0.5%鸽血球0.050.050.050.050.050.050.05混匀、力口盖置4C过夜或室温2小时0.5%鸽血球0.050.050.050.050.050.050.050.050.05混匀加

6、盖 1 小时（三）血凝抑制操作方法按下表进行。孔号成分1234567血清对照血球对照9.0 盐水(ml)血 清(1:10ml)0.0250.0250.025、*0.025窝 0.025、0.025* 0.025 卜0.025+ 0.02不0.025、0.025)0.025百 0.025、0.025& 0.0250.0250.025 弃0.025血凝集（4单位ml）0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025混匀，放室溫12 小时观察结果。（吴 斌）乙型脑炎反转录聚合酶链反应（RT-PCR）1材料准备：待检材料、组织匀浆器、TEN缓冲液、氯仿、无水乙

7、醇、异丙醇、75%乙醇、 TRI20L裂解液、RT-PCR试剂盒。引物：扩增乙型脑炎病毒中447-P77之间50/bp基因片段，由上海生物工程公司合成， 其序列为：上游引物 5TCA TGT GGC TCG CGA GC3下游引物 5TCT GTA AGC CGG AGC G3仪器设备：凝胶电泳紫外检测仪、PCR扩增仪、电泳仪2操作步骤21 样品采集 对于病死或扑杀动物，取脑组织，脑脊髓液血清等，对于待检活猪，无菌 采集血液，收集血清，冷藏送检。2. 2病毒RNA抽提 所采病料经组织研磨器充研磨，按1： 5用TEN缓冲液悬浮收集于 离心管中，反复冻融3次后经7000rpm离心5分钟，取上清液。

8、取上清液(或血清)250J l 并加入750J l TRIIOL裂解液于室温作用10-15分钟，加入氯仿2001，剧烈振荡，室温下放 置10-15分钟，再于12000rpm离心15分钟。待分层以后，吸虫上层水相约500p 1,加入等 体积的异丙醇，混合后置室温下沉淀RNA用适量的灭菌DEPC水溶解，立即进行RT-PCRo2. 3 RT-PCR操作程序按RT-PCR试剂盒操作说明书进行。反应体系(50p 1)组成如下：10 X缓冲液25mM MgCh 10mM dNTPsRNA 酶抑制剂AmV Rtase XL AmV-optimized Taq 引物Temp1ate 灭菌 DEPC 水5 1 10 1 5 1 1 1 1 1 1 12 110 113 1反转录条件为50C 30分钟扩增条件，94C变性2分钟，进入循环，94C 3秒，58 C 40秒，72C 2分30秒，35 个循环后72C延伸10分钟。2. 4 RT-PCR产物的检测。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶、电泳、溴化乙锭染色、在紫外光下 观察与标准分子量比较，即可获得结果。