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1、PCR技术的发展及应用平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，K
2、orana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应6。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响18。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理1,2PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板
3、，借助一小段双链 DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下， DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，3，方向延伸，合成一条新的 DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性退火延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2
4、-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。2、 PCR技术的反应组份2.1 模板DNAPCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链 DNA，可以是基因组DNA 或 cDNA，mRNA 也能作为PCR的模板，只需用逆转录酶把 mRNA 逆转录为cDNA即可。模板量的多少及其纯度的高低，是PCR成败与否的关键因素之一6。由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定, 模板DNA不需要高度纯化，但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染18。PCR所需模板DNA的量极微(通常在纳克级范围内)，通常适宜的模板DNA浓度为30-50ng，不到1纳克的
5、基因组DNA序列就足以用来进行PCR分析，甚至用1个DNA分子就能扩增出特定的DNA 序列。 A-变性；B-退火；C-延伸 图1 PCR原理（摘自 邓小红等, 2007）2.2 引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR引物是一段与待扩增DNA序列互补的寡核苷酸片段，长度大多为 10-30个碱基。一般情况下，一对引物包含5，端与正义链互补的寡核苷酸片段和3，端与反义链互补的寡核苷酸片段，这两个寡核苷酸片段在模板 DNA 上的结合位置之间的距离决定 PCR 扩增片段的长度。PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合的靶 DNA 序列必须是已知的，设计引物时尽可能的选择碱
6、基随机分布的序列，尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异常序列。避免引物自身形成发夹结构等二级结构，尤其是两个引物之间不应存在互补序列，尤其是在引物的3，末端，即使无法避免，其3，端的互补碱基也不能多于2个，以减少“引物二聚体”的形成。否则会影响靶DNA序列的扩增。在合成新链时，DNA聚合酶将单核苷酸添加到引物的3，末端，因此引物3，端的5- 6 个碱基与靶 DNA 片段的配对必须精确、严格。两个引物中G+ C碱基对的百分比( G+ C%)应尽量相似，若待扩增序列中GC 含量已知时，引物的 GC 含量则应与其类似。一般情况下，设计引物时，G+ C 碱基对含量以40% - 60%为佳，解链温度 ( m
7、elting temperature,Tm) 应高于55。2.3 DNA聚合酶最初的DNA聚合酶是从大肠杆菌中提取得到的DNA聚合酶I的Klenow片段。该片段具有DNA聚合酶活性和3，-5，的外切核酸酶活性，能识别和消除错配的引物末端，以校正复制过程中错配的核苷酸。但是它有一个缺点，即Klenow 片段对热很敏感，DNA的变性温度就可以使酶失去活性，因此在PCR的变性步骤之后都必须重新添加聚合酶，否则实验无法继续进行，这样增加了PCR操作的繁琐程度，而且反应效率低，成本增加。后来，在美国黄石国家公园的温泉中发现了嗜热菌-水生栖热菌(Thermus aquatics, Taq)，从中分离提取出
8、了一种DNA聚合酶。由于这些聚合酶具有95以上的耐热性，只要在PCR反应开始时加一次聚合酶，就能在整个PCR循环中保持酶活性，大大简化了PCR操作程序，提高了PCR扩增效率，从而使PCR 技术得到了进一步完善。目前，Taq DNA 聚合酶在PCR反应中广为应用。2.4 dNTPsdNTPs ( dATP、dCTP、dGTP和dTTP ) 是PCR反应中靶DNA序列扩增的原料。dNT P在温度较高时容易失活，因此需要在- 20 下冰冻保存，以保证 dNTP的质量。在PCR 反应中，dNTP浓度以50-200mol/L为宜，但是也不能低于10- 15mol/L。dNTP浓度过高易引起非特异性PCR
9、产物，还会抑制Taq 酶的活性；浓度过低则会影响扩增产量。尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等，否则就会引起错配。2.5 M g2+缓冲液PCR反应的标准缓冲液通常含有10mmol/L Tri-s HCl (pH8.3)，50mmol/L KCl和1.5mmol/ L MgCl2。PCR反应体系中Mg2+的浓度非常的重要，当各种dNTP浓度为200mol/L时，M g2+浓度为1. 5-2. 0mmol/L时为宜。当M g2 +浓度过高时，会使反应特异性降低，出现非特异扩增；当浓度过低时会使Taq DNA聚合酶的活性降低，使反应产物减少。同时，Mg2+的有效浓度受到高浓度的螯合剂、高浓度的
10、带负电荷离子基团的影响，比如EDT A、磷酸根等。它们可与Mg2+结合从而降低Mg2+的有效浓度。因此，每当首次使用靶序列、引物、dNTP(含磷酸根)的新组合时，都要将Mg2+浓度调至最佳。通常的方法是设置一组反应实验，每一反应的Tri-s HCl (10mmol/ L)和KCl (50mmol/ L)浓度相同，MgCl2浓度不同 ( 0.05- 5mmol/ L，每次增加0.5mmol/ L ) ，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来比较各反应扩增产物的量，从中选出最佳的Mg2+浓度。3、PCR相关技术的发展3.1 PCR芯片传统的PCR扩增仪的缺点是体积大，因此所需的样品量
11、大，热容量也大，降低了反应效率。随着微电子机械系统（microelectromechanical system, MEMS）技术的发展，wilding于1994年首次成功的在硅芯片上完成了PCR扩增反应。PCR芯片的原理是把硅制薄片的反应器代替传统的 塑料小管用于PCR反应，构成了一次性PCR芯片4。. 与传统PCR仪相比，PCR微芯片具有体积更小，反应速度加快、操作更加简便、价格低、样品使用量少、节省试验成本、集成化、结果可靠等优点。芯片表面的化学材料的特性对PCR的成功起到关键的作用。没有经过表面处理过的裸露的以及一些硅相关的材料对PCR扩增反应起抑制作用24。目前通常使用的方法是对芯片中
12、的微反应池/通道的内表面进行钝化处理4，比如对反应接触面进行硅烷化及多聚物处理，或者在芯片表面添加一层二氧化硅以消除芯片表面对PCR的影响12。利用微电子机械系统（MEMS）技术不仅可以制作PCR芯片，实现DNA片段的迅速扩增，而且可将整个分子生物学的实验过程包括采样、稀释、抽提、进样、扩增、分离、检测等集成在微芯片上，实现分析系统从样品处理到检测的整体微型化、集成化与便携化，并最终实现微全分析系统(Micro Total Analysis System，-TAS)或称为芯片实验室(Lab On Chip)。PCR芯片实质上就是在固相载体上固定与研究对象相关的许多已知基因的引物阵列，并且用于P
13、CR检测，其制作时最关键的是目的基因的引物设计17。基于芯片的PCR技术主要有两种模式：一种是试剂在温度循环变化的管道区间中连续流动实现PCR扩增，称为连续流动PCR微芯片；另一种是试剂不动，而芯片腔体的温度迅速循环变化实现PCR扩增，称为PCR微池芯片。前一种方式容易实现集成化，后一种方式的反应速度要比前一种快。根据不同的需要，可将不同的PCR技术与芯片结合，如利用微加工技术制备的微型PCR芯片5、实时定量 PCR芯片9、荧光定量PCR芯片17等。3.2 固相PCR 所谓固相PCR，就是将特定引物寡核苷酸通过不同的方法共价固定到固相支持物上来扩增目标DNA。固相支持物有琼脂糖小珠、乳胶小珠、
14、聚丙烯酰胺小珠、普通玻片、磁珠、硅片等。在固相支持物上固定核酸的方法有两种，1）将核酸的末端修饰上氨基，比如利用氨基与甲苯磺酰基或肼基的反应来固定核酸； 2）将核酸的末端磷酸化修饰，再通过磷酸基团与其他功能基团结合将核酸固定在固相支持物表面。容易分离纯化PCR产物是固相PCR的主要优点。例如用琼脂糖小珠固定引物与RT-PCR相结合, 就能很方便地构建cDNA文库12。图2 桥式固相PCR原理 （摘自 陶生策等, 2001）3.3 电子PCR 电子PCR( Electronic PCR, e-PCR)是一种新概念，主要是用于基因组作图12。 现在已经成为常用的核苷酸序列电子分析工具，它在DNA
15、片段的染色体定位、基因组测序、基因组辅助作图、PCR引物辅助设计和基因克隆等方面都发挥着重要的作用20。电子PCR技术是利用生物信息学数据库作为平台，借助相应的分析运算软件，搜索要查询的DNA序列( query sequence) 是否含有序列标记位点 ( Sequence Tagged Sit, STS)，并且根据序列标记位点（STS）在已知基因组图谱的位置将所查询的DNA 序列在基因组图谱上进行定位21。它的原理与BLAST相似，但是BLAST是将所查询序列与数据库中序列的全长进行比对，而电子PCR是将所查询序列与数据库中STS序列两端的PCR引物序列进行比对。从一定意义上说，电子PCR
16、是一种不需要具体实验操作的，并且借助于某些生物信息数据和专用分析软件在计算机上进行的PCR技术，而BLAST是类似于电子杂交技术。3.4 简并PCR简并PCR是于20世纪90年代初建立起来的用于细胞遗传学中特异扩增DNA的技术，它根据密码子存在的简并性设计寡核苷酸引物，并进行聚合酶链式反应，由于该PCR反应不需要知道要扩增DNA片段的核苷酸序列，所以该技术在很多领域都得到广泛的应用。PCR最初是为了扩增已知序列设计的，简并PCR技术能扩增未知的序列。当待研究的基因序列不明，仅仅知其一部分蛋白质的氨基酸序列，可根据已知氨基酸序列合成一组简并引物，进行PCR扩增，对基因家族中的未知基因进行分离15。要成功的进行简并PCR的关键是设计好两组引物库和对反应条件进行优化10。 简并PCR技术是寻找和发现”新”基因和蛋
