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1、生化实验讲义思考题参照答案实验一 淀粉的提取和水解、实验材料的选择根据是什么？答：生化实验的材料选择原则是含量高、来源丰富、制备工艺简朴、成本低。从科研工作的角度选材,还应当注意具体的状况，如植物的季节性、地理位置和生长环境等，动物材料要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等，微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分的差别等。2、材料的破碎措施有哪些？答：(1） 机械的措施：涉及研磨法、组织捣碎法; () 物理法：涉及冻融法、超声波解决法、压榨法、冷然交替法等; (3)化学与生物化学措施：涉及溶胀法、酶解法、有机溶剂解决法等。实验二 总糖与还原糖的测定1、碱性铜试剂法测定还原糖是直接滴
2、定还是间接滴定?两种滴定措施各有何优缺陷？答: 我们采用的是碱性铜试剂法中的间接法测定还原糖的含量。间接法的长处是操作简便、反映条件温和，缺陷是在生成单质碘和转移反映产物的过程中容易引入误差;直接法的长处是反映原理直观易懂，缺陷是操作较复杂，条件剧烈,不易控制。实验五 粗脂肪的定量测定索氏提取法（1)本实验制备得到的是粗脂肪，若要制备单一组分的脂类成分,可用什么措施进一步解决？答：硅胶柱层析,高效液相色谱,气相色谱等。(2）本实验样品制备时烘干为什么要避免过热？答：避免脂质被氧化。实验六 蛋白质等电点测定1、在分离蛋白质的时候,等电点有何实际应用价值？答:在等电点时,蛋白质分子与分子间因碰撞而
3、引起聚沉的倾向增长,因此处在等电点的蛋白质最容易沉淀。在分离蛋白质的时候，可以根据待分离的蛋白质的等电点,有目的地调节溶液的pH使该蛋白质沉淀下来，从而与其她处在溶液状态的杂质蛋白质分离。实验七 氨基酸的分离鉴定-纸层析法1、如何用纸层析对氨基酸进行定性和定量的测定?答: 将原则的已知氨基酸与待测的未知氨基酸在同一张层析纸上进行纸层析,显色后根据斑点的R值,就可以对氨基酸进行初步的定性,由于同一种物质在同一条件下有相似的Rf值；将点样的未知氨基酸溶液和原则氨基酸溶液的体积恒定,根据显色后的氨基酸斑点的面积与点样的氨基酸质量成正比的原理,通过计算斑点的面积可以对氨基酸溶液进行定量测定。、纸层析、
4、柱层析、薄层层析、高效液相层析各有什么特点？答： 支持介质层析原理层析方向上样量分离效率纸层析滤纸分派上行（多）或下行小低薄层层析玻璃板或塑料板分派、吸附上行较大较高柱层析玻璃柱分派、吸附、离子互换、分子筛、亲和层析等下行可小可大较高高效液相层析不锈钢柱分派、吸附-可小可大高实验八 蛋白质含量的测定（）简述紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理及长处。答:原理：由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环具有共轭双键，因此蛋白质具有吸取紫外线的性质，吸取高峰在28 m波长处。在此波长范畴内，蛋白质溶液的光吸取值(OD280)与其含量呈正比关系,可用作定量测定。长处：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不
5、干扰测定。实验十 影响酶活性的因素(1）本实验中如何通过淀粉液加碘后的颜色的变化来判断酶促反映快慢的?答：在唾液淀粉酶的作用下，淀粉水解,通过一系列被称为糊精的中间产物，最后生成麦芽糖和葡萄糖。变化过程如下：淀粉紫色糊精红色糊精麦牙糖、葡萄糖淀粉、紫色糊精、红色糊精遇碘后分别呈蓝色、紫色与红色。麦芽糖和葡萄糖遇碘不变色。因此反映后颜色如为蓝色阐明酶活力低，淡黄色则阐明酶活力高。（2）如何通过加入班氏试剂后生成沉淀多少来反映酶促反映快慢的？答：淀粉与糊精无还原性，或还原性很弱,对本尼迪克特试剂呈阴性反映。麦芽糖、葡萄糖是还原糖,与本尼迪克特试剂共热后生成红棕色氧化亚铜的沉淀。因此,产生红棕色氧化
6、亚铜的沉淀越多阐明酶活力越高。（)通过本实验,结合理论课的学习,小结出哪些因素影响唾液淀粉酶活性?是如何影响的？答:温度、H、激活剂、克制剂等。高于或低于最适温度或p,酶活力都会减少；激活剂和克制剂不是绝对的，只是相对而言，随着浓度的变化而变化。实验十二 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定(1) 试阐明用硫酸铵分级分离酶的措施及应注意的事件。答：用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的措施。由于硫酸铵在水中溶解度很大(2，每升可溶760克)，并且对许多酶没有很大的影响,因此它是最常用的盐。例如：某酶（或蛋白质）发生盐析的范畴为35-6%饱和硫酸铵的浓度,因此可先选择饱和硫酸铵浓度,去沉淀杂蛋白,然后选
7、择%饱和硫浓度酸铵，留沉淀(含所要的酶)。注意事项：在用硫酸铵沉淀酶蛋白时,要注意缓冲液的pH值和温度，盐的溶解度随温度不同而有较大的变化，同步酶的溶解度亦随温度的变化而变化。在加硫酸铵时,需事先将硫酸铵粉末研细。加入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽量避免泡沫的形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。(2) 用正丁醇解决匀浆液可以有效地使碱性磷酸酶酶蛋白释放，使酶的产量大大提高,这是为什么?答:由于碱性磷酸酶酶是一种膜蛋白,正丁醇解决后可使结合在膜上的蛋白质更多地释放出来。(）酶活力测定期,为什么必需先将酶液对缓冲液透析后才测定？答:清除盐离子的影响。实验十三 凝胶过滤层析纯化碱性磷酸酶1.
8、 在本实验中要注意哪些重要环节?答：1） 注意辨别柱子的上下端。2） 各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损,否则导致漏气、漏液。3） 装柱要均匀，既但是松,也但是紧,最佳在规定的操作压下装柱,流速不适宜过快,避免因此凝胶。4） 始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发，凝胶变干。也要避免液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。5） 核酸蛋白检测仪，记录仪，部分收集器要对的连接。6） 要控制一定流速。7） 收集得到的液体要进行酶活力的检测。实验十四 底物浓度对酶活力的影响（米氏常数的测定)1. 在测定酶催化反映的米氏常数K和最大反映速度Vm时,应如何选择底物浓度范畴?答：底物
9、浓度选择范畴 S0.-5.0 Km为宜。底物浓度选用还应当注意其倒数能均匀分布。/ 0 /S 0 1/S 底物浓度太大 底物浓度太小2. 试阐明米氏常数K的物理意义和生物学意义。答：(1） K是酶的一种极重要的动力学特性常数, Km物理含义:S络合物消失速度常数与形成速度常数之比；其数值相称于酶活性部位的一半被底物占据时所需的底物浓度。() 可根据Km估计底物浓度的水平。（3) Km可作为同工酶的判断根据。（4) 鉴别最适底物。(5) 有助于在酶学研究中对底物浓度的选择。选用10Km浓度进行活力测定3. 为什么说米氏常数Km是酶的一种特性常数而Vm则不是？答：某种酶的Km在给定的体系中不随酶浓
10、度变化而变化,也与酶的纯度无关，因此是酶的一种特性常数。但m随酶浓度变化而变化。实验十七 SDS-PAGE电泳() 简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量的原理;答:1）SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质D复合物。 ）SD带有大量负电荷,当它与蛋白质结合时,消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差别,使DS与蛋白质的复合物都带上相似密度的负电荷。 )SS-蛋白质复合物在水溶液中的形状同样,都是近似于雪茄烟形的长椭圆棒。 4)不同的S-蛋白质复合物都带有相似密度的负电荷,并具有相似形状；因此在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数
11、。(2)与否所有的蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳措施测定得到的分子量都完全可靠?答:不是。 如电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白)以及某些构造蛋白如胶原蛋白等。 例如组蛋白F1,它自身带有大量正电荷，因此,尽管结合了正常比例的SS,仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响,它的分子量是,000，但SDS-凝胶电泳测定的成果却是35，0。实验十八 维生素C的定量测定（1）简述本法测定C的利与弊。答：碘量法测定VC相比其他措施老式的碘滴定法迅速、简捷，但易受到待测物颜色干扰而不易判断滴定终点;只能测定待测溶液还原型的Vc含量,如果溶液中还具有其她还原型较强的物质会影响测定成果;并且待测的还原型Vc易被空气氧化影响滴定成果。(2)为什么以显蓝色在0s内不褪色为滴定终点？答:由于本措施是根据氧化还原反映测定的，待测的的溶液中也许具有其她比还原性低的物质，也能使碘分子被还原,使蓝色褪去,如果把这部分还原物质所消耗的碘液计算进去,会照成误差，因此以显蓝色在0s内不褪色为滴定终点。
