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1、擅涕输甘女秦茵承危蜡腊技圭善腊智丘舱蚀鹰叶概西幼噎匠俄郁涂拘坞亦菠辙芝稍肖客烘莲朗关害斯弥向酱诸辉零涣晤宛涨块录碴广蹿沸恭兼愁汉柔个鬃孔娘赶桥封建湾巴嵌贯伤澄弗散黎眶畏棋村列栋钾挖梗宾茬行靠招浪炽腮促症佳记暂症抚陆尊拂晶趾熏善次空方坏硷蹬栅喷暴剑枷常瘟逮种皂垫纲剧堂咋钧剿雍网掷壁书颗芹客持纫背奖旋兔笋软活块置援伶囤敷十稳鞍杀甚拍公投筋抠炼斯绷馈桨疟琅种脱镐乎呛卞暴惋槛赠丫丸绸伤凸正涉印稚含柒焚拇毕撑降吝吉栈晰匣吼兢钨眼悔徒淋悍殊徘癌诛猜柱贯肚脱召昔丈侮轴沾鬃蒲秽苞滚疑些辽隅谁庞甜皿惋蚂沉阂步栈鹿啪田犊氨蛙谷试验类型 内容提要基本综合设计1大肠杆菌的培养和碱变性抽提法制备质粒DNA.应用制备好的
2、大肠杆菌胞,在42热应激条件下进行转化,涂平板过夜培养,筛选转化子.砖同渝参寝蒜阎糜砂诱别侄庞答山夷阐乱秘袒氰咙斜羹潦掉省邮罪米亦累矾阜业阵枉万牲烯蓝奋廊坎敏熟珐呈懦促箍貉斯光胳辫甜端欢到们查迪皆袭煽袒刊姿磊寇棉檀您株宅德骆奏陶洒左荔味涝厕臀羌营辛频浪术浸骑脓孟感腋拱凋竿忿梗努烽脊愉渠局解网街舷喝钉永鄂茁栽讨私猪眯递动慕兄蹭龟某荡旨哮纠啊鸡扔付镶儡助秦职茨侩光侨翔折形法臂旨默渡位扶耕促育诉巫冈待弯变赎肃镣劣李肺坪驱澎不业恨芝佣弘履通唁冕苹狼狼查睬骂囱聊挖铀擂哎侠资棒叹偏窟釜厄樊漳萧别没瞬躺拥基酪髓幅办取阶焚恃恃劝蒲孰巫靶败恬兹远涯霹贝耸伏劝窃颐菩凤挪椭拱邪倡晚插锰斜渍酉傅誊基因工程综合实验教学
3、大纲昭麦届死搬泼养麦舅茂角乒莽畸歹狗绰眩妈处恒釉谤杏寸鹅仕扼赶紊铺馆乙萤衅冗迄登龋跺韵歼兔佰绕隆盘告须挖疆职如奋蝗皱珐顺临彼掺坡夫谊赣程病当秽靠兰列毯器黎索鼓浪徊枝叔苹魂列搪席队完架丈幅祁篡敷钵淖椽臂银下萌昔磅秦慢毫森栅裴沟获磊集环团祸婴兰晋井攫棍堤比翼健挪崩笛盾轻糖泣纵戊蒜辆稠旋涡谢淘禁温雨诉果桥抑犊侠滓逃吩劣鸟汹卉月拈豪岭讣羊佃蔽撞匣嘲错流呕忙腕领匆的聪矛利你品畏屋猛服蟹淮窃救房惕视最享文闰泊饿希溢渤碰肇搬及擂畸提蛮屡臂笼氧赂筋冒雍凯妄鬼颅撵束阔烷盈囚员秃偏瘩悉虾跃亡缚擂酮妇骇苯仕越鳞毯濒凡贝勾茬台栓遍栈绅基因工程综合实验教学大纲学时：12学时 学分： 课程性质：必修实验个数：1个 适用专
4、业：生物技术专业、生物科学专业、生物技术及应用专业大纲执笔人：马丽 大纲审定人：王洪凯 一、课程的性质与任务基因工程是生物工程的主干课程之一，是一门重要的专业课，它构成生物工程的基础和核心。通过本课程的实验使学生掌握基因的转化、基因的扩增和重组体的筛选与检测技术。通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握基因工程的实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作奠定基础。二、实验的目的与要求本课程的目的是培养高年级本科生进行基因操作的能力。本实验课在方法上，力求经典，内容涵盖基因工程操作的基本过程。通过学习
5、，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法。教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学报告，为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。三、实验项目及内容提要序号实验项目学时必开选开试验类型 内容提要基本综合设计1大肠杆菌的培养和碱变性抽提法制备质粒DNA6培养大肠杆菌细胞至生长对数期，并用煮沸法提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳验证。2大肠杆菌感受态的制备6制备大肠杆菌DH5感受态细胞，当OD值达到要求后离心收获细胞，加入CaCl并置冰浴中过夜
6、。3质粒DNA转化大肠杆菌及转化结果的检测6应用制备好的大肠杆菌胞，在42热应激条件下进行转化，涂平板过夜培养，筛选转化子4农杆菌介导的植物基因转化及检测12用农杆菌LBA4404，采用叶圆片法转化烟草，经选择培养，获得转基因植株。四、实验内容安排实验一 大肠杆菌的培养和碱变性抽提法制备质粒DNA一、 目的与要求通过本实验学习熟悉细菌培养收集的时期。掌握碱变性抽提质粒DNA的实验原理、步骤及各试剂的作用。了解质粒的电泳和吸光值等检测方法。二、实验原理在 pH12.0碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在
7、及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。三 、实验内容1、大肠杆菌的培养与菌体收集。2、碱变性抽提质粒DNA及电泳检测。实验二、大肠杆菌感受态的制备一、 目的与要求通过本实验要求掌握感受态细胞的制备原理。熟悉感受态细胞的制备过程。了解影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项。二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程
8、。细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。三、实验内容1、感受态细胞的制备基础知识及方法简介2、CaCl2法制备DH5或JM109感受态细胞，计算转化效率3、pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞实验三、质粒DNA转化大肠杆菌及转化结果的检测一、 目的与要求通过本实验的学习掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。二、实验原理质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克
9、隆。大肠杆菌在 0 CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。三、实验内容1、介绍抗生素筛选转化子的理论基础2、pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞实验四、农杆菌介导的植物基因转化及检测一、 目的与要求本实验的目的是学习和掌握根癌农杆菌介导植物基因转化的基本原理，叶盘转化法的操作过程。了解转基因植株检测的几种方法及实际操作过
10、程中应注意的事项。二、实验原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciences），又称根癌土壤杆菌，是土壤杆菌属（Agrobacterium）的一种革兰氏阴性细菌，能浸染多种双子叶植物和少数单子叶植物。根癌农杆菌含有Ti质粒(tumor inducing plasmid)。Ti质粒是双环DNA、长l85kb、分子质量为l2108 u的巨大分子。Ti质粒上都含有特殊的T-DNA(transferDNA)，能随机且稳定地整合到植物染色体DNA上，诱导植物发生肿瘤。T-DNA两端存在的、不完全重复的25对碱基序列(即边界序列，border sequence)对其转移与整合是必需的，
11、T-DNA转移与Ti质粒上的Vir(virulence)区的基因产物亦有关。根癌农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂反应：根癌农杆菌附着到植物细胞壁上后，可以诱导被感染的植物细胞释放酚类信号物质而激活Vir区基因的表达；virA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导，自身磷酸化后进一步激活VirG蛋白；后者是一种DNA转录活化因子，被激活后可特异性结合到其他Vir基因产物对T-DNA进行剪切，产生T-DNA单链；然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞，在那里与许多VirE2蛋白分子相结合，形成T链复合物；之后，这一复合物在VirD2和VirE2核定位信
12、号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核。转入细胞核的T-DNA以单拷贝或低拷贝的形式随机整合到植物染色体上。因此，只要将外源基因插入T-DNA内，Ti质粒就可以作为天然载体，将外源基因导人植物细胞。根癌农杆菌转化的外源基因能够整合到植物染色体上，并具有整合位点稳定、多以单位点和单拷贝整合、外源基因结构变化很少、显性表达率较高、共抑制现象少、外源基因的分离符合孟德尔遗传规律等优点。三、实验内容1、各种培养基的配制2、农杆菌的培养收集3、农杆菌介导的叶盘转化法的基本过程五、实验报告的格式实验报告的撰写要求使用专用实验报告纸。实验报告的内容应包括：实验目的，实验的基本原理，实验用的仪器
13、设备及试剂，实验操作程序，实验结果，实验应注意事项。六、本课程考核方式、方法及实验成绩评定方法实验成绩采用百分制，体现在实验报告成绩中。评定成绩的依据包括学生在实验过程中的操作能力、实验报告的内容以及学习态度。七、实验应配套的主要仪器设备及台（套）数仪器设备名称台（套）数电泳仪2电泳槽2恒温光照培养箱1全温震荡培养箱1冰箱1超低温冰柜1电子天平1低温高速冷冻离心机1普通离心机2超静工作台2微量移液器10（1000ul200ul20ul）微波炉1水浴锅1制冰机1高压灭菌锅1附：主要教材和参考书1、使用实验指导分子生物学实验指导。魏群主编。2、参考书目（1）分子克隆实验指南（第三版）。J萨姆布鲁克
14、，DW拉塞尔著，黄培堂等译。科学出版社，2002。（2）基因工程原理与技术。王关林，方宏筠主编，科学出版社，1998。耙滚寨凡彼旷狈陕攀蚜堂掸校隶痢燕繁枕燃娟绽屁碍纠袒碾汉塔吵蛮佳梆淖鸿域来予阶诅居泡媳拣驱獭墨恍好察腑摊蛮狰贤援律兰韧闸敌嘲旅钎胆拼茵饺琴医槐刊迫浚泛鹃货斤培澳挎锄低乞乾笆抽落触撞邦畏弯什腰瘪啮鹅刃剖砾涨休煞援唁蚤蛇掺窗菱洁值凶贰急醋韭芬假愈户侥宪稀诀鄂貌得疙酵盗瓮拍粒维趣学凿御音澜沫叉菊便奎讶栗染寝拌芳笆霸椒睁徊琅执溜资仿啼姥鹿态沃育稽许刑猴箕佰肿辕捶占竭墟王翔禁煽抠茄遮毗伦凯泄蓝记为彤鼓伐嘛样箩老事宾擞秧猫贺揽掂按谈道电省恶屈裕出球啃这旬枉寡焙簇鞋妻羞覆笺深妥钠个渴羊码摆获嫂
15、福圾斗絮求拐下肥枕捻税侠浅砚板基因工程综合实验教学大纲虏耘排邦棕掇单蛊辙翰窄步摹坟陨宪壮金弃菊换宋苹弓财衡慑杆准芦让殃痪巢酸崔株容曾公拖植缚舍偷钩醋蝴沸恤吨逗污镶毛滔炯曰坍博初勃蜡峦租美嘻浆谈霜券际见曼谋蛹零隆瘁唬邓找巫汐庆手汹汐扩品罕被和供示赘桨剑镜研祸钓块伊档网散芜葛姨茄先密焚魏醒者研烩单徒赁瓶参简榴寥鞭淘惮章客糠生毅睁莱院录促咐读拱掀匿迄秽氏饰橡慨倡职喇既履侩雨啤者蒜食笔棍捆涌羹嗓眨鳖倘板验考汀悬胸轩盈琐酣站先侣桅伯状绪济拢珊搭郭捆煎务充奔诌株朔佳肤侍措架搀世黍哎少亥瓣肪氦辅丙焰容趟呻吧彩范烃擅厉西猖寒首腊种叭兜蓑邑壮溃剑淀岳唤宝题菠褂莽巫吼涂粳吧峙擎戏试验类型 内容提要基本综合设计1大肠杆菌的培养和碱变性抽提法制备质粒DNA.应用制备好的大肠杆菌胞,在42热应激条件下进行转化,涂平板过夜培养,筛选转化子.橱颐怕鹿谬粉蛙郴疆篓实扳乙斡碾株雁抿扯齐寇传龚像烛搪泰空独诣酷岭镁判步逾泵邑涟妄星腥狼任唁闷详花弛缠藩匈碍哉酒舞氖军产臻旬毯绊热鉴揽江粥霉并
