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1、EBER检测试剂盒（原位杂交）（操作之前请详细阅读此说明书） 检测原理和意义EBER是EB病毒编码的小RNA，是EB病毒的表达产物，在EB病毒感染的细胞核中以高拷贝数存在。根据EBER的特有序列设计的EBER单链 DNA探针能特异地与EBER靶序列互补、杂交，从而检测EB病毒是否存在。此方法检测石蜡组织切片中的EB病毒具有极高的特异性和灵敏性。目前EBER原位杂交已成为组织和细胞中EB病毒的标准检测方法，在国际上广为使用。 试剂盒提供的材料和试剂成 份保存方法提 供 量20人份50人份1EBER杂交液-20400ul1.0ml2蛋白酶K440ul100ul3一抗41ml2.5ml4二抗41ml
2、2.5ml5HRP聚合物41ml2.5ml6DAB底物41ml2.5ml7DAB 420ul50ul818X18mm盖玻片4/室温20片50片9湿盒增效液4/室温30ml30ml（注意：EBER杂交液请 -20保存）整理为word格式 用户自备材料和试剂1. 55恒温培养箱8.二甲苯2. 37恒温培养箱9.酒精3. 光学显微镜10. PBS(pH=7.6)4. 移液器11. 苏木素5. 计时器12. 氨水6. 玻片染色缸和染色架13. 盐酸酒精7. 湿盒2个 整理为word格式 实验前需配试剂30湿盒增效液取湿盒增效液及蒸馏水，按3:7配制成30%湿盒增效液备用。 实验时需配试剂A、1X蛋白酶
3、K将蛋白酶K与1PBS按1：25的比例配制备用。（现配现用）B、DAB显色液依据需要配制DAB显色液，以可覆盖整个组织的量为宜。取DAB与DAB底物，按照1：50的比例混匀，避光保存备用。(现配现用) 操作步骤1切片处理：将4um厚度的组织粘附在APES处理的载玻片上，切片于60-70烘烤60分钟以上。（建议每次实验同时附加阳性、阴性对照片）2脱蜡及水化：溶液次数时间（分）二甲苯3 10100%酒精1 395酒精1 x 380%酒精1 3蒸馏水1 x 3（注意：使用过的二甲苯，应相应延长脱蜡时间，以保证脱蜡完全）3蛋白酶K消化：甩干切片, 将组织周围液体用滤纸吸干, 每张切片滴加适量1蛋白酶K
4、工作液(约50 ul，根据组织大小增、减量), 整理为word格式室温孵育5分钟。蒸馏水洗涤11分钟，小心擦干组织周围液体。4杂交：4.1 每张切片滴加适量杂交液(约20 ul，根据组织大小增、减量)，并加盖玻片（本试剂盒配备，可根据加入杂交液量进行剪裁）；4.2 放置水湿盒中，55恒温箱孵育60-90分钟；4.3 转至37孵育4-16 小时（放置于30%湿盒增效液湿盒中）。建议过夜（16小时）以保证低拷贝样本的杂交效果；4.4 48（PBS 预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，继续浸泡5分钟；4.5 48 PBS洗涤3x 5分钟 (轻微振荡容器)；（注意：盖玻片规格应与杂交液量匹配，切片在整个试
5、验过程中要保持湿润状态，防止干片）5信号放大与显色：5.1 小心擦去组织周围液体，滴加适量一抗(约50 ul，根据组织大小增、减量)，37，水湿盒中孵育30分钟；37 PBS浸泡3x2分钟（轻微振荡容器）；5.2 小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育20分钟；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)；5.3 小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物(约50 ul，根据组织大小增、减量)，室温，水湿盒中孵育30分钟；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)。5.4 小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液(约50 ul，根据组织大小
6、增、减量)，室温，水湿盒中孵育约10分钟（不同样本的显色时间可能有所差别，建议镜下观察显色过程）；室温PBS浸泡3x2分钟 (轻微振荡容器)。5.5 自来水冲洗，苏木精复染（可用盐酸酒精分化及氨水返蓝）。梯度酒精脱水，中性树胶封片。 阳性结果判断标准：仅为细胞核着色。胞浆和胞膜着色不能视为阳性，只有当核分裂时可以出现胞浆阳性着色。 其他事项：本试剂保质期为12个月。客户在收到产品时请及时检查，如发现有外包装破损、试剂盒成分不全等产品问题，或者在使用过程中有任何疑问，请及时与泰普客户服务中心联系，我们将及时为您解决。 公司信息：公司名称：福建泰普生物科学有限公司整理为word格式总部：福建省福州
7、市金山金洲北路7号金山科技企业孵化器7号楼4层 邮编：350002 电话：800-804-8333，0591-2805 3600 传真：0591-2805 3700研发中心：北京市昌平区北清路中关村生命科学园创新大厦A座207室 邮编：102206 电话：010-8072 0071 传真：010-8072 0072整理为word格式操作步骤简表操 作参 数1二甲苯3X102100%酒精1X3395%酒精1X3480%酒精1X35蒸馏水1X36酶消化室温,57蒸馏水18加杂交液适量955变性60-901030湿盒增效液的湿盒中孵育37，4-16h11PBS（用前48预温）脱片浸泡1-5+512PBS（用前48预温）浸泡3X513加一抗37，3014PBS（37）浸泡冲洗3X215加二抗室温，2016PBS浸泡冲洗3X217HRP聚合物室温，3018PBS浸泡冲洗3X219DAB显色室温，2-1020PBS浸泡3X221自来水冲洗122复染，脱水，封片常规 友情提示：本资料代表个人观点，如有帮助请下载，谢谢您的浏览！ 整理为word格式
