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1、分子平台项目书食品药品检验检测中心分子生物学平台建设项目书尊敬的领导：感谢贵单位给我机会向你们介绍分子生物学平台建设方案，该分子平台包 含PCR电泳成像系统、荧光定量PCR仪、微滴式数字PCR系统、全自动病原微 生物检测系统、脉冲场电泳系统，以及酶标仪洗板机、蛋白纯化系统、细胞分 选系统等，通过有机结合，技术互补，实现目前行业内最领先最专业的分子检 测技术，为食品药品安全提供整体的解决方案。该分子平台可开展的应用与研究方向包括但不限于：1、病原微生物快速检测、活菌定量检测、致病菌溯源2、动物源性成分的定性与定量分析3、转基因成分的定性与定量分析4、中药材的真伪鉴别5、生物制品的检测6、药物安全
2、评判7、检测新技术的研究及试剂盒的开发等一、分子平台应用实例31、食源性致病菌快速检测32、致病菌活菌定量检测73、致病菌溯源104、动物源性成分检测145、肉类及肉类制品中的成分掺假和虚标196、转基因成分定性与定量检测237、中药真伪鉴别328、生物制品检测379、药物安全评判43二、要紧仪器介绍441、PCR电泳成像系统442、CFX96Touch型荧光定量PCR系统453、QX200微滴式数字PCR系统464、iQ-Check全自动病原微生物检测系统475、脉冲场电泳系统486、蛋白纯化系统497、细胞分选系统50三、分子平台举荐规划51四、分子平台举荐配置52、分子平台应用实例1、食
3、源性致病菌快速检测背景介绍民以食为天，食品作为人们日常生活中不可或缺的一部分，它的安全关系到人类的生命安全和生存进 展，而食源性致病菌是威逼到当前食品安全的重要因素之一。尽管近年来由食源性致病菌引起食物中毒事 件的报道数量有所减少，然而据美国CDC公布的检测报告显示，实验室检出食源性菌如沙门氏菌的概率并 没有降低，因此食源性致病菌对公共健康的威遍仍不容小觑1 o传统检测方法尽管是食源性致病菌检测 的金标准”，但因其操作繁琐，需要耗费大量的人力、物力和时刻，专门难满足基层日常检测和执法需 求。专门在我国，一方面食品需求数量庞大，另一方面食品的加工生产却呈规模小、零散等特点，因此要 保证我国民众的
4、食品安全，提高抽样覆盖率是十分必要的。假如使用传统的检测方法，不管从时刻上依旧 经费上都无法满足食品抽检的需求。因此，有必要研发和普及一些检测速度快、费用低、灵敏度高的快检 技术来更好地应对和操纵食源性疾病的爆发。检测技术目前，文献报道的食源性致病菌快检技术有专门多，例如：免疫学检测技术、代谢学检测技术、分子 生物学检测技术、生物传感器检测技术等。不同的检测技术各有特点，然而能满足检测速度快、费用低、 灵敏度高、操作简单等特点，并适用于基层执法和检测需求的技术要紧为免疫学检测技术和分子生物学检 测技术。其中，免疫学检测技术具有较好的特异性、灵敏性，检测效率高、费用低，对人员要求较低且不需要 大
5、型仪器等特点，因此目前应用得最为广泛。然而免疫学检测技术也具有一定的局限性：例如当待测样品 中含有目标物的竞争性物质时，专门可能会显现假阳性的检测结果：免疫学检测对反应体系环境要求较 高，错误的选用试剂会直截了当造成检测失败等。随着分子生物学技术的飞速进展，目前差不多能够实现在分子水平上对食源性致病菌的鉴定。其中最 为便利、快速和适用广泛的鉴定技术要数聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction PCR) PCR 技术起源于20世纪80年代，由美国的Kary Mullis发明。PCR技术要紧是在体外合适条件下，以DNA(或 RNA)为模板，以一对人工合成的寡核甘酸为引
6、物在耐热DNA聚合酶作用下特异性扩增目的DXA片段的技 术。整个反应由20-45个循环组成，每个循环均包括高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤。近年来， 用PCR技术检测食品中食源性致病菌的方法有专门多种，如常规PCR、不对称PCR、免疫PCR、套式PCR、 荧光实时定量PCR (qPCR)、多重PCR、逆转录PCR等。2005年，范宏英等2运用多重PCR技术成功的将 沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌0157、绿脓杆菌和副溶血弧菌5种饮用水不得检出的致病菌同时 快速检出。2020年，程晓燕等3建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒的方 法，取得了较好的实现成
7、效。目前，基于Taqman探针的荧光实时定量PCR检测技术差不多被广泛应用于 食品性致病菌的检测中，并制订了相应的检验标准。在2021年新公布的食品安全国家标准鲜(冻) 畜、禽产品(GB 2707-2021)等127项食品安全国家标准中，同样涉及到了 PCR及qPCR的检测技术。因 此，在前增菌和选择性增菌后，应用PCR技术能够对样品中是否含有食源性致病菌进行检测，这种检测技 术的优势在于检测效率高、特异性好以及灵敏度高等。表1.基于PCR技术进行食品致病菌检测的部分行标和国标标准编号标准名称SN/T1059. 7-2020 SN/T 1870-2007 SN/T 2415-2020 GB 4
8、789. 6-2021 GB 4789. 12-2021 GB 4789. 42-2021进出口食品中沙门氏菌检测方法实时荧光PCR法食品中致病菌检测方法实时荧光PCR法进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法实时荧光PCR法 食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验 食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验伯乐解决方案美国伯乐（Bio-Rad）公司作为生命科学领域的领先者，一直致力为众多科学家解决实际科研应用问 题，提供全套解决方案。所推出的iFCheck全自动病原微生物检测系统，包括核酸提取及通过认证的定 量检测试剂盒、
9、自动化工作站（可选）、定量PCR仪器和专业的分析软件，仅需一步增菌，在8-24小时内 获得结果，为致病菌快速、准确检测提供了最正确解决方案，其具体特点如下：1）检测项目：配套18种常见的致病菌检测，包括：沙门氏菌、大肠杆菌0157:H7、产志贺毒素大肠 杆菌、对0族的大肠杆菌进行确认和鉴定（检测7个要紧的血清型:0157:H7, 0111, 026, 0103, 0145, 045, 0121）、单增李斯特氏菌、李斯特菌属、弯曲菌、肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌、阪崎 肠杆菌、军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母菌：其中军团菌、嗜肺军团菌和酒香酵母可进行定性和定量检 测：对市而上其他厂家各种致病菌检测试
10、剂盒兼容性好：2）检测兼容性：多种致病菌和检测项目可同时同机进行：3）检测性能：检测中含内标质控和阳性对比，内部质控指示没有假阴性反应，有效幸免检测的假阴 性，所有检测项目都为Taqman探针；4）病原菌DNA提取：专利的提取流程至少提取100ul增菌液，无需离心，一步即可提取DNA,提取时 刻15分至30分钟。且可整合最新的Free DNA去除处理方案，有效去除食品中死菌DNA干扰，专门适 合通过辐照、巴氏消毒处理或以噬菌体作为加工助剂等类型的食品样本：5）仪器开放性：此检测仪为开放性操作平台，厂家配备的检测试剂盒在2-24小时检测目标菌：非厂 家配备试剂检测时刻可能会有所延长：6）检测灵敏
11、度：检测食品仅需一步增菌，检出限W lCFU/25g：7）检测通量：94个样本加上2个对比：8）定量PCR仪特点：6通道检测，配备触控屏，可单机操作；9）定量PCR仪温度操纵：具有动态温度梯度功能，能够同时运行8个不同的温度：10）定量PCR仪温控准确度：0.2C：温度均一性：0.4C：11）定量PCR仪最高升降温速率：2.5/秒；12）认证认可：软件分析系统及试剂获得AORC、AFNOR等国内、国际认证，结果自动判读：直截了当 读取有或 无的结果；13）扩展使用：除可用于致病菌检测外，本系统还可应用于核酸定量、基因表达水平分析、基因突变 检测、GYO检测及产物特异性分析、流行病学试验等多种检
12、测、研究领域：14)数据分析：能够对病原微生物进行定性和定量检测，并可进行标准曲线的绘制，并有中文软件及 免费升级；15)质控功能：每份测试的试剂内均自带质控功能，仪器能直截了当确认每一份测试的试剂质量图L Bio-Rad iQYheck全自动病原微生物检测系统手动流程自诩福1,培养岩菌 f2提取菽收集增菌 播拼裂解细胞f3,加小搬的。附建立 PCR体系并犷增f4 .软件自欹淅结果并 出具傩图2. iQ-Check手动及自动病原微生物快速检测流程Reference1 Bakthavathsalam P, Rajendran VK, Saran U, et al. Immunomagnetic
13、nanoparticle based quantitative PCR for rapid detection of Salmonella J Microchim Acta, 2021, 180：1241- 1248.2范宏英，吴清，吴假设菁，等.饮用水中5种致病菌多重PCR技术检测研究J.微生物学通报, 2005, 32(3): 102-107.3程晓燕，刘庆慧，黄捷.实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒方法的建立J.安徽农业科学, 2020, 38(26): 14265-14267.2、致病菌活菌定量检测背景介绍从前而我们明白，食源性致病菌检测关于食品安全检测的重要性，而关于食品中活菌
14、的定量检测才能 其实反映出该样品的污染水平，因此如何幸免一些通过幅照、巴氏消毒等处理后的样品中死菌的干扰而仅 定量检测活菌含量就显得至关重要。传统方法如分离培养法等不能满足快速检测的目的，而现有的致病菌 基因检测方法如一般PCR、qPCR等常常无法有效识别食品中的活菌和死菌，导致假阳性的结果。因此开发 快速、准确的定量检测活菌的方法专门有必要。检测技术目前，研究者们利用活菌和死菌细胞膜完整性不同，开发了 EMA-qPCR/PCR和PMA-qPCR/PCR法。其 中，叠氮滤化乙锭（EMA）和趣氮澳化丙锭（PMA）是一种结合能和DXA共价交联的光敏材料，光照能够使 EMA/PMA的光敏基团转化为氮
15、宾自由基，其能够和DNA发生共价交联，进而阻断DNA分子的PCR扩增，同 时这种染料只能选择性的渗透死菌的细胞膜，因此可被用于和PCR技术相结合定量检测活菌。然而有研究 发觉，EMA具有细胞毒性，可进入部分活性细胞内阻碍检测结果，其应用受到限制，因此目前研究中更多 采纳无细胞毒性的PMA染料结合qPCR法定量检测食品中的活菌含量1, 2 .除了 qPCR技术外，数字PCR技术（digital polymerase chain reaction, dPCR）是近两年来新兴的 生物分子检测技术，以一种全新的方法进行核酸分子的灵敏检测和绝对定量，与传统PCR、定量PCR相 比，其结果的精确度、准确性和灵敏度均有大幅度提升，被称为 第三代PCR技术，标志着PCR技术以 后进展的方向。伯乐解决方案：结合PMA处理的微滴式数字PCR法美国伯乐公司作为数字PCR技术的开拓者和领导者，开发和研制了最新型的QX200微滴式数字 PCR（droplet digital PCR, ddPCR）系统，其技术原理是可将核酸模板、引物/探针等组成的荧光PCR反应 体系均一等分为近2万份纳升级稳固的 油包水微滴（微反应单元），等于将有限的目的模板进行近似于 无限的稀释分开，在通过PCR扩增之后，含有模板的微滴会检
