基因克隆(包括DNA提取技术步骤)

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1、基因克隆DNA 克隆是指在体外将目的基因或 DNA 片段同能够自我复制的载体 DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过 程，又称为重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的 DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞 技术和重组子筛选技术等。一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一 DNA 提取取 0.5 克以下的鱼类组织或 20ul 血液：1准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织

2、放入离心管，破碎。（常温操作） 2恒温箱裂解，55C。30min。3加等体积Tris饱和酚（酚：氯仿：异戊醇25： 24： 1），先颠倒混匀后静置抽提 10分钟，离心4度12000g 10分钟。（注意酚在油层下面）4取上清（把枪头去掉部分，注意液面。蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位 于上层水相中），加入等体积CI（氯仿：异戊醇24： 1），先颠倒混匀后静置抽提10 分钟，离心4度12000g 10分钟。5汇集上清，加2倍无水乙醇（-30度保存），颠倒混匀可观察到絮状DNA。在-30 度冰箱沉淀30min。离心4度12000g 10分钟。6弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分

3、钟。7 重复一次上述操作。7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。8 溶解于 200ulddwater。9 定量 DNA。裂解液的配制1ml 体系200ul0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。作用抑制酶的活性螯合 DNA 酶发挥作用需要的金属离子50ul10%SDS （蛋白质变性剂）10ul1MTris-cl（PH=8.0 高压灭菌）缓冲溶液5ulPK （消化）735ul灭菌超纯水EDTA(0.5 M，pH8.0)将186.1 g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H20）加入800ml水中，在磁 力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH值至8.0 （约需20g NaOH颗粒），定容至1L。

4、 分装后高压蒸汽灭菌。EDTA二钠盐加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0时， 才会溶解。实验二目的DNA片段的获得（酶切）获得了包含目的基因在内的DNA,这些DNA或来自于目的生物基因组DNA 或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA。由于基因组DNA较大，不 利于克隆，必须将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法是核酸限制性 内切酶消化。仪器：台式离心机 、 恒温水浴 、取液器、 电泳仪 、电泳槽、 紫外观测仪 试剂EcoRI,Hi nd III酶,DNA 样品（浓度 0.3|jg/|jl） 1X TAE 缓冲液。操作（一）EcoR I单酶切。1, 取1支干净、灭菌新Eppen

5、dof管，分别按下表加入（ul）灭菌水13EcoRI缓冲液 2DNA43ugEcoRI110U20ul 体系。2, 37C保温14小时，也可过夜。3, 保温结束后65-70C10min灭活酶（如为热稳定性酶，则用氯仿抽提）。4，取10pl左右的反应液加入1卩1电泳加样缓冲液，电泳。目的片段回收。 注意：1,样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。2, 加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。3，反应体系的体积要尽量少，要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10。4, 为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，因此如 底物DNA浓度过低则应进

6、行真空浓缩。实验三 LB 培养基的配制LB 培养基是- 一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。含有酵母提取物、 蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源、能源和磷酸盐，蛋白胨主 要提供氮源，NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝 固剂。琼脂在常用浓度下96C时溶化。琼脂在40T时凝固（高压灭菌融化琼脂 糖），通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气 温不同而有所不同。LB培养基用来培养细菌，将其pH调至中性或微碱性，利于细菌生长繁殖。器材和试剂酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂，氨苄青霉素（Amp）； lmol/L NaOH； 锥形瓶，烧

7、杯，量筒，玻璃棒，细菌培养皿，培养基分装器，天平，牛角匙，高 压蒸汽灭菌锅，pH试纸，记号笔，纱布，封口胶。1000ml体系LB液体培养基：参考分子克隆实验指南在 950 ml 去离子水中加入 :胰化蛋白胨 （bacto-typtone）10g ，酵母提取物 （bacto-yeast extract） 5g ，NaCl10g摇动容器直至溶质溶解 .用1mol/LNaOH （大约1ml ）调pH至74 （适合E.coli的生长） 用去离子水定容至 1L.在 15psi 高压下蒸汽灭菌 20min. （全过程需要 2 小时）锡箔。常温保存。 氨节青霉素（Amp），用无菌水配制成50mg/mL溶液，

8、置-20C冰箱保存。LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉。1. 称量 按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g. 放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。2在烧杯中加入950 ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解用1mol/LNaOH （800ul）调pH至7.4，再用去离子水定容至1L。转移到试剂瓶中再加入 加15g琼脂粉。高压灭菌。2抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到55 C时（手可触摸）在超净台加入 1/500 体积 50mg/ml 抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并 充分摇匀。一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。（类

9、似琼脂 糖制胶）3. 倒板：一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外 下照 10-15 分钟。4. 保存：用封口胶封边，并 倒置放于4C保存，一个月内使用。1kg=1000g 1g=1000mg 1mg=1000ug 1ug=1000ng试验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 (超净台)细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化(Transforma tion )是指质粒DNA或以它为载体的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0C, CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷 酸复合物粘附于细胞表面，经42C短时间热击处

10、理，促进细胞吸收DNA复合物。 将细菌放置在非选择性液体培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新 表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含氨苄青霉素的选择性固体培养基上。 【仪器、材料与试剂】(一)仪器1. 超净UV工作台 2.低温4C离心机 3.恒温摇床37C 180rpm/min4. -80C冰箱 5.恒温水浴器(二)材料1. 氯化钙(CaCl) 2.LB培养基(液体)3大肠杆菌DH5a (kit) 4. 50mL离心管25. 吸嘴、小指管 6.试管、培养皿、锥形瓶等 ( 三 ) 试剂1. 0.05 mol/L CaCl溶液(分子量110.98 )灭菌后4C保存。22. 氨苄青霉素(A

11、mp),用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20C冰箱保存。3. LB液体培养基。大肠杆菌感受态细胞的制备1. 从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于含有5 mL LB液体培养基的试管中， 37 Co 180rpm/min振荡培养过夜。2. 取5 mL菌液转接到一个含有100 mL LB液体培养基1000ml锥形瓶中，37C 180rpm/min 振荡培养 90min。3将菌液转移到冰预冷的50 mL离心管中，冰上放置10 min。4. 4C,离心 10 min(4 000 r/min),回收细胞。 5倒出培养液，将管倒置1 min以便培养液流尽。6. 用冰冷的0.05 mol/L CaCl 2

12、0mL悬浮沉淀，立即放在冰上保温10 min。27. 4C 4 000 r/min，离心 10 min，回收细胞。8. 用冰冷的2 mL 0.05mol/L CaCl悬浮细胞(务必放冰上)。加入甘油至终浓度2 为15%；9. 使用1.5ml离心管分装细胞，每200 ul 份。此细胞为感受态细胞。-80C保 存备用。本实验使用生物公司感受态大肠杆菌 DH5a。本实验使用克隆载体质粒是 PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的 DNA 片 段得以扩增。2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中

13、有较多的拷贝，便于结合更大的外源 DNA 片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因 Amp），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限 制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型 的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。（蓝白斑法）DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage）， 柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载

14、 体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC ）等。从总体上讲，根据载体的使用 目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。T7 1EcoRI Sac I Kpnl Aval Smal Bam HI Xbal Sall Accl Hindi Pstl Sphl HindlllY寸莒8僉rttast1 5511362890846 9122223334455 6PGEM（R）-3ZF（+） VECTOR 酶切位点及复制起始点。本实验使用克隆载体质粒是PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR规格目录号数量价貉况;pGEl奨就個 20lle&81P2251pGE? E JZff-

15、j V?z toi- 20?说明:pGEMZfi；+用pGEM-3Zf-) 旣血由冈!営衍生 而来含有丝状噬菌牡坨的复制起点口载体上的(3-半乳糖昔齬的肽編码医中有塞克隆位点容克隆位点旁边还含有EF师TTRN一谋合酶启动子门)o选用合适的E. mil菌株(比如尽；i於)就能通过蓝白筛选的方法把萤肚插入失活的重组克隆克接鉴别出来哆克隆位点区域含有一些单一的限制性位点 如EcoRI： Saci KpnZ: Aval SmL.BamHL Xbal7 Sail, Acd, Hindi； Pstl7 SphllKHiiidino pGEM- 迄f(-)和pGEMT药-就悻除了 fl起点的方向外苴它都呈-亠样的口 阂此可以作为标准克隆载体体外转录的樓板也可用于制备环化sDNAo特点 蓝白谎选:能方便地鉴定重组克隆“ 通便此载怀能用于标堆克隆 車谨OXA制备以及在与冬克隆区威相连的5P3和T- RX_碌合酶启动子的作用下进行体外转录口 方便总克隆区域的具有劣种限制