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1、实时荧光定量PCR方法简介一 实时荧光定量PCR的基本原理理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用
2、新的参数Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。Ct值是如何得到的在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。Ct值的定义Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对应的横坐标。Ct值与样品中模板的对应关系Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝
3、数的对数，y代表Ct值）。与终点法相比利用Ct值的优势由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止
4、PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，直接丢弃含有大量扩增产物的反应管，彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。二 荧光定量PCR的2类方法（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBR Green法）染料法即利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方法与常规的PCR类似，唯一的区别是在反应体系中加入了SYBR Green染料分子。该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。与EB的性能类似，SYBR Green也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低
5、的荧光本底，当反应体系中存在dsDNA时， SYBR Green能特异性的与之结合并在497nm激发下。 染料法的优点：1，无需设计、合成探针，实验成本低；2，使用方便，与常规PCR的操作几乎相同。 染料法的缺点：1，由于SYBR Green与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除了与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反应过程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBR Green的上述特点，该方法不能应用于Multiplex
6、 QPCR技术。（在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况）探针法（以TaqMan探针为例） 探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于：在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。目前市场上的探针主要种类有：TaqMan、Molecular Beacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最广泛。 TaqMan探针的结构：长度与普通PCR引物类似，大约20bp左右。在5与3端各标记有一个荧光基团，5的荧光基团称为报告基团（Repo
7、rt），3的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。 TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能够通过FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer）将接受的能量转移到淬灭基团，使后者以发射荧光或热量的方式释放能量，而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。 TaqMan探针法工作原理： 变性（95C）：模板dsDNA充分解链； 复性、延伸、酶切降解（60C）：1，探针与靶序列结合；上、下游引物与靶序列结合；3，上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链（53聚合功能）；4，当
8、上游引物延伸到TaqMan探针的5端时，延伸不能继续，此时Taq酶发挥53外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成； 荧光信号的检测：由于TaqMan探针被水解，报告基团在受到激发后不能再通过FRET作用将接受的能量转移给淬灭基团，因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号，起始模板浓度越高荧光信号越强。 与染料法相比TaqMan探针法的优点：1，实验的特异性得到了提高；2，对探针的5端采用不同的荧光标记就可以进行Multiplex QPCR。 与染料法相比TaqMan探针法的缺点：1，探针的使用提高了实验成本；2，探针的使用需要设计及优化。三 确定样品起始模板拷贝数的2类方法绝
9、对定量 采用绝对定量的方法需要使用标准品（已知起始拷贝数的样品）建立标准曲线，建立Ct值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系，从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。标准品的种类：含目的基因的质粒（经酶切线性化处理，其中的插入片段必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、PCR扩增产物（经纯化，必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到）、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等，前2种标准品使用较为广泛。标准品的定量：UV A260、荧光分光光度检测等。为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性，必须进行归一化的处理：1，对各样品进行细胞计数，使各样品的起始细胞数一致（可操作性不强
10、，尤其是针对组织、肿瘤等样品）；2，对纯化后得到的总RNA进行定量，使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。相对定量与绝对定量不同，相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物（mRNA）的具体拷贝数，而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率，即基因的差异化表达。就研究目的而论，该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下：公式说明：Rel.Quantity：目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数；GOI：目的基因（Gene of Interest）；Norm：内参基因（Reference Gene，N
11、ormalizer，House Keeping Gene）Eff：PCR扩增效率，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率；使用该公式时，需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算；如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%，也可将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-Ct 。 为什么需要设立内参基因？如果仅仅比较目的基因的Ct是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的，最主要是受到3个变量的影响：1，样品处理时不同的纯化得率；2，RT-PCR过程中不同的逆转录效率；3，QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。由于上述3个
12、变量在样品间都很难控制在相同的水平上，因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理，使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的，这样得出的结果才具有可信性与良好的重复性。（注意：内参基因的（1+EffCt）位于分母的位置，进行除法的运算。） 如何选择内参基因？符合什么标准的基因可以作为内参基因？由于上述内参基因的用途，因此内参基因的选择必须满足以下3个条件：1，在不同的细胞、组织中具有恒定的表达；2，在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达；3，在不同的实验状态下具有恒定的表达。内参基因的Ct一般小于2（即小于1倍的表达差异），一般采用的内参基因都是一些管家基因，使用最多的
13、为：-actin、GAPDH、18sRNA等。需要注意的是：并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因，还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达，不能作为内参基因。因此在选择内参基因时建议：1，查阅相关文献；2，设立多个内参基因；3，采用表达谱的方法确定理想的内参基因。 采用Singleplex还是Multiplex？可以采用Singleplex的方法在不同的反应管内得到同一样品目的基因与内参基因的Ct值，再利用上述公式进行计算。在这种情况下可以使用SYBR Green法进行实验。也可采用Multiplex的方法在一个反应管内得到同一样品目的基因与内
14、参基因的Ct值，再利用上述公式进行计算。采用TaqMan探针法（目的基因与内参基因的探针进行不同的荧光标记）可以采用Multiplex的方法。Multiplex对于Singleplex的优点：1，节约了样品的使用量，尤其是针对样品比较珍贵的情况；2，可以加快实验的速度，节约实验成本；3，避免了Singleplex的误差，因为目的基因与内参基因是在不同的反应管内得到的。四 引物与探针的设计QPCR引物设计与常规PCR引物设计的原则基本相同，需特别注意的就是为了尽可能使PCR扩增的效率达到100%，因此QPCR扩增产物的片段长度一般小于400bp，在设计引物的时候尽可能将产物长度控制的短些。引物与
15、探针设计的要求：1，高PCR扩增效率，接近100%；2，高特异性，扩增过程中没有非特异性产物；3，实验的重复性，相关系数接近1。SYBR Green法（引物设计基本原则） PCR扩增产物长度范围100400bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构； 引物的GC含量为3080%，最佳范围5060%； 引物的Tm值范围为6267C，上、下游引物的Tm小于2C； 引物序列中避免出现连续4个相同的碱基； 避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C； 引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有一些比较大的Intron； 利用BLAST或其他引物设计软件（如Beacon Designer） 对引物的特异性进行检查。TaqMan探针法（引物设计基本原则） PCR扩增产物长度范围70150bp，扩增片段中避免出现强烈的二级结构； 先确定探针的位置与序列再设计相对应的引物； 引物的GC含量为3080%，最佳范围5060%； 引物的Tm值范围为5860C，上、下游引物的Tm小于2C； 引物序列中避免出现连续4个相同的碱基； 避免引物本身或引物间形成二级结构，在引物3端最后5个碱基中避免出现2个以上的G或C； 引物最好设计在不同Exon的区域，其间含有
