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1、第一章 基因工程基因工程是狭义的遗传工程，遗传工程的核心是构建重组DNA分子。基因工程也称为“重组DNA技术”。第一节 工具酶的发现和基因工程的诞生基因工程的理论基础：DNA是遗传物质，DNA的双螺旋结构，以及遗传信息的传递方式。基因工程的技术保障：限制性核酸内切酶，DNA连接酶和质粒载体发现与应用。一、限制性核酸内切酶：能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。（平末端和黏性末端）限制性核酸内切酶可作为切割DNA分子的手术刀，它的发现和应用，使DNA重组成为可能。二、DNA连接酶：将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起，形成的DNA分子称为重组DNA分子。DNA连接酶具有缝合
2、DNA片段的作用。三、质粒：能够自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于大型DNA分子之外的方式存在，是一种特殊的遗传物质。最常用的是大肠杆菌的质粒，其含有抗生素抗性基因。标志基因工程诞生的试验：通过重组，使大肠杆菌同时具有四环素和卡那霉素的抗性。四、基因工程的载体载体是运载外源DNA进入宿主细胞的车子，即运载工具。除质粒外，基因工程载体还有 入噬菌体、植物病毒和动物病毒。入噬菌体：将外源基因载入大肠杆菌等宿主细胞。植物病毒：将外源基因带入植物细胞。动物病毒：将外源基因带入动物细胞。第二节 基因工程的原理和技术基因工程的基本原理是让人们感趣的基因（目的基因）在宿主细胞中稳定和高效表达
3、。基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、载体和宿主细胞。基因工程的基本操作步骤：A目的基因的获得；B重组DNA的形成；C重组DNA导入受体细胞（宿主细胞）；D筛选含有目的基因的受体细胞；E目的基因的表达。一、获得目的基因目的基因序列已知：化学合成方法合成目的基因，PCR扩增目的基因。目的基因序列未知：构建基因文库。二、形成重组DNA分子用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体，两者形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子。三、将重组DNA分子导入受体细胞受体细胞：大肠杆菌，枯草杆菌，酵母菌和动植物细胞等。质粒做载体：受体细胞应该选择大肠杆菌，用
4、氯化钙处理大肠杆菌，增加其细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。四、筛选含有目的基因的宿主细胞载体上含有抗性基因，含有重组质粒的受体细胞可以在抗性培养基中生长。五、目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的功能物质。第三节 基因工程的应用一、基因工程与遗传育种转基因植物：基因工程克服了远缘亲本难以杂交的障碍。转基因动物：指转入了外源基因的动物。传统的育种方法费时，费力。二、基因工程与疾病治疗1、基因工程药物：生长素释放抑制激素，胰岛素，生长激素，干扰素，乙型肝炎疫苗等。胰岛素：一种蛋白质激素。干扰素：干扰素是病毒侵入细胞后产生的糖蛋白。干扰素具有抗病毒、抗细
5、胞分裂、免疫调节等多种生物学功能，是治疗病毒性肝炎和肿瘤的药物。2、基因治疗：是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，达到治疗的目的。三、基因工程与生态环境保护利用基因工程技术来改善环境。如：利用转基因微生物吸收环境中的重金属，降解有毒化合物和处理工业废水。第四节 基因工程的发展前景一、科学家在基因工程方面的最新尝试光合作用：植物和某些细菌（蓝藻，又名蓝细菌，是一种原核生物）。生物固氮：自生固氮微生物、共生固氮微生物和联合固氮微生物。自生固氮微生物：A光合固氮微生物B化能自养固氮微生物C异养固氮微生物生物反应器：利用转基因的栽培植物和饲养动物来生产蛋白药物或者疫苗，将动植物作
6、为生物反应器，希望降低产品价格。蛋白质工程：利用基因工程对天然蛋白质进行改造，以便获得具有理想生物学功能的蛋白质。蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的。二、基因工程的未来第二章 克隆技术生命的基本特征之一：自我复制和自我繁殖。繁殖分为无性繁殖和有性繁殖。有性繁殖：经过异性生殖细胞的结合，产生合子，再由合子发育成下一代个体的繁殖方式。无性繁殖：不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式。无性繁殖的个体保持了亲本的遗传性状，一次产生后代的数量可以很大，可以迅速扩大其种群数量。第一节 什么是克隆个体通过无性繁殖可连续传代并形成群体，这样的群体称为无性繁殖系，即克隆。克隆技术：从
7、众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择，获得目的基因或特定类型细胞的技术操作。当用于个体水平的描述时，克隆是一种通过单个细胞，特别是来自特定个体的单个体细胞进行无性繁殖，从而产生新个体的过程或技术。一、无性繁殖与克隆只要不通过两个分子、两个细胞或两个个体的结合，只由一个模板分子、母细胞或母体直接形成新一代分子、细胞或个体，就是无性繁殖，即克隆。在分子水平上，基因克隆是指某种目的基因的复制，分离过程。在细胞水平上，细胞克隆技术在杂交瘤制备单克隆抗体的操作中得到充分运用。从理论上讲，由于细胞核具有基因组全套遗传信息，生物的体细胞有潜力直接发育成胚胎和形成与核供体完全相同的个体克隆，但实际上动物胚
8、胎发育的条件和基因调控机理复杂，动物克隆的实现并不是一件简单的事情。二、克隆技术的发展1、微生物克隆：由一个细菌分裂（复制）出多个和它完全一样的细菌而形成菌落。2、遗传工程克隆：如DNA克隆。用特定的限制性核酸内切酶切割某个DNA 分子（目的基因），把它重组到被限制性核酸内切酶切割出匹配末端的载体分子上，再把这样的杂合分子导入特定的宿主细胞（如细菌）这一导入过程叫转化。在被转化的宿主细胞中可以随着重组载体复制出大量的目的基因，这就是DNA克隆或基因克隆。3、个体水平上的克隆：不通过两性细胞的结合，从一个单一的细胞繁殖出生物个体。注：动物的克隆，都是用胚胎细胞作为供体，利用细胞核移植技术取得成功
9、的，而克隆原意是无性繁殖系，因此，胚胎细胞克隆不属于严格意义上的动物个体克隆。三、克隆的条件1、具有包含物种完整基因组的细胞核的活细胞（如乳腺上皮细胞）2、能有效调控细胞核发育的细胞质物质（去核卵的细胞质）3、完成胚胎发育的必要环境条件（诱导核-质重组细胞生长，分化的试验条件和怀胎母体的子宫环境）第二节 植物的克隆植物克隆的技术基础是：植物组织培养植物细胞全能性：植物体的每一个生活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育为完整植株的潜能。一、 植物组织培养程序：植物组织块切口处的细胞在创伤刺激下脱分化分裂的细胞分裂增殖愈伤组织芽和根的顶端分生组织新的植株1、胚性细胞：胞质丰富，液泡小而核大。胚
10、性细胞在适宜的培养基中，发育成胚状体，胚状体继续发育，形成植株。2、用纤维素酶和果胶酶水解细胞壁，可以获得分离的植物细胞原生质体（细胞中有代谢活性的原生质部分，包括细胞膜，细胞质和细胞核），用适当的方法进行原生质体培养，也可以获得新植株。二、植物细胞全能性的体现植物体几乎所有组织（如根，茎、叶、花药、子房及幼胚等组织）的细胞，通过诱导都可再生新植株。也就是说，植物体的每个生活细胞，即使是已经高度成熟和分化的细胞，都保持了恢复到分生状态的能力，都具有遗传上的全能性。由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，细胞全能性的表达程度大不相同。如拟南芥等能在多个世代中保持细胞全能性的表
11、达，而小麦，玉米等在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力。三、细胞培养和器官培养细胞培养：单细胞细胞团球形胚心形胚胚状体完整植株有的植物（如风信子）可以在愈伤组织的基础上直接发育出花器官。器官发生和形态建成主要是通过平衡植物激素配比进行调控。如：适量的激动素和细胞分裂素配比可以诱导芽的分化；适量的吲哚乙酸及适当减除其他某些激素，则可以诱导生根。四、 原生质体培养和植物细胞工程植物细胞工程的操作过程：培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过细胞融合、显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组
12、细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。第三节 动物的克隆动物克隆的技术基础：动物的细胞培养和组织培养。一、动物的细胞培养和克隆形成细胞是构成生物有机体的基本结构和功能单位。1、动物细胞、组织培养（1）动物细胞培养：首先，将动物体内的一部分组织取出，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞；然后在人工控制的培养条件下，使这些细胞得以生存并保持生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡性能等生命活动现象。在细胞培养中，由于细胞之间并非彼此独立而是在生命活动中互相依存，所以在某种程度上像体内一样呈现一定的组织特异性。（2）动物组织培养：动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长特性。动物组织培
13、养过程中可以伴随组织分化。2、动物组织培养技术的发展在细胞培养中，有原代培养和传代培养。将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶就称为传代培养。3、细胞系，细胞株细胞系泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。4、克隆培养法把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，叫做克隆培养法或者细胞克隆。细胞克隆的最基本要求：必须保证分离出来的细胞是一个而不是多个，即必须肯定所建成的克隆来源于单个细胞。二、动物的细胞融合技术及其应用细胞工程是细胞水平上的生物工程，其主要的技术手段是细胞培养和细胞融合。1、细胞融合与细胞杂交细胞融合是指两个或多个细胞融合成一个细胞的现象
14、。植物细胞的原生质体可以相互融合，动物细胞在一定的物质（灭火的仙台病毒，聚乙二醇等）介导下可以相互融合。细胞融合可以在基因型相同或不同的细胞间进行，其中基因型不同的细胞间的融合就是细胞杂交。2、杂交瘤技术和单克隆抗体制备杂交瘤技术制备单抗的基本方法：（1）用外界抗原刺激动物（小鼠，兔子等），使其发生免疫反应，使B淋巴细胞产生抗体；（2）利用仙台病毒或者聚乙二醇等介导，使经免疫的动物脾细胞与可以无限传代的骨髓瘤细胞融合；（3）经过筛选，克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生特异抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。杂交瘤技术的最大优点：可以从特异抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗。三、动物的克隆
15、繁殖1、动物细胞全能性的表现程度受精卵具有全能性，即具有使后代细胞形成完整个体的潜能。（多能细胞单能细胞）2、动物难以克隆的根本原因细胞分化使得细胞发生基因的差异表达3、细胞核移植实验和动物的克隆繁殖核移植：利用一个细胞的细胞核（供体核）来取代另一个细胞中的细胞核，形成一个重建的合子。胚胎核移植的成功率远高于体细胞。多莉羊问世证明体细胞核移植成功。体细胞羊的克隆证明：(1)高度分化细胞经过一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能；（2）在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源细胞核）发育的作用。动物细胞融合：电脉冲第三章 胚胎工程第一节从受精卵谈起动物的胚胎发育是指受精卵发育成幼体的过程。一、受精作用成熟的精卵融合成为受精卵的过程称为受精。受精包括：精卵识别，精子附着于卵膜、精卵质膜融合等几个过程。同种动物精子、卵细胞表面有特异性相互识别的蛋白。二、胚胎发育的过程受精卵是个体发育的起点。受精卵卵裂卵裂球继续分裂囊胚（胚泡）外表的一层扁平细胞称为滋养层，胚胎的附属结构及胎盘由滋养层发育而来。囊胚内部的细胞团不断增殖分化，发育成完整的胚胎原肠胚
