DNA定点突变实验

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1、DNA 定点突变实验 标签： DNA 定点突变DNA 定点突变可以：（ 1）研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性；（2）改造启动子或者 DNA 作用元件；（ 3）提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药 物研发、基因治疗等等方面。详细实验方法Dpn I 法定点突变是指通过聚合酶链式反应（ PCR ）等方法向目的 DNA 片段（可以是基因组，也可以是 质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化） ，包括碱基的添加、删除、点突变等。单点突变的原理是从常规 E.coli 中经纯化试剂盒 （Miniprep） 或者氯化铯纯化抽提得到质粒。 设计 一对包

2、含突变位点的引物（正、反向） ，和模版质粒退火后用 PfuTurbo 聚合酶 “循环延伸 ”，（所 谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物 5端终止，再经过反复加热褪火 延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。 ）正反向引物的延伸产物退火 后配对成为带缺刻的开环质粒。 DpnI 酶切延伸产物， 由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌， 是经 dam 甲基化修饰的，对 DpnI 敏感而被切碎（ DpnI 识别序列为甲基化的 GATC ，GATC 在 几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次） ，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而 实验方法原理不被切开，因此在

3、随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。多点突变的原理是准备多个带突变的引物 （同方向，对同一单链模版） ，退火后全部突变引物 （不 超过 5个）都结合在同一环状单链模版， PfuTurbo 聚合酶延伸，碰到下一个引物就停止，各片 断经连接成环，和单链模版组成杂和环， Dpn I 消化双链模版，也消化杂和环中的模版，只留下 新合成的带多个突变的单链环（ mutant ssDNA ），得以转化 E.coli ，形成双链质粒。资料表明， 引入 3个定点突变的效率为 60% ，5个定点突变的效率为 30% 。得到的其他质粒是带有较少定点 突变的质粒，以引入 3个定点突变为例，就是有 40%

4、 左右的转化质粒是带有 1-2 个不同定点突变 的质粒（因为存在 1-2 个引物结合模版延伸形成单链环的可能） 。实验材料 DNA试剂、试剂盒 pyrobest DNA 聚合酶 DpnI 去离子水 BSA 大肠杆菌 DH5a 菌株 仪器、耗材 PCR 仪离心管移液枪枪头枪头盒水浴锅灭菌锅培养箱、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点， 引物一般长 2545 bp ，设计的突变位点需位于引物中部。、反应实验步骤 1. 使用高保真的 pyrobest DNA 聚合酶，循环次数少，一般为 12 个循环。2. 反应体系：1) 10x pyrobest Buffer ： 5 ul2) dNTP Mix

5、ture(10 mM)：1 ul3 )模板 DNA(550 ng)1ul4) primer 1 (125 ng) ： 1 ul 5) primer 2 (125 ng) ： 1 ul（ 6） pyrobest DNA polymerase （TaKaRa ）（5 U/ul） ：0.25 ul（ 7）加无菌蒸馏水至 50ul.三、产物沉淀纯化1. 加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20 C冰箱）5min，离心弃上清。2. 7075% 乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用 DpnI 酶切）。四、DpnI 酶切1. 酶切体系（ 1 ） Buffer ： 2 u

6、l（2） BSA （100 X） : 0.2 ul（ 3 ） DNA ： x ul（4） DpnI： 0.5 ul（ 5）加无菌去离子水至 20 ul 。2. 30 C酶切14 h。3. 65 C水浴15min终止反应。五、转化将酶切产物转化大肠杆菌 DH5a 菌株，利用抗生素筛选突变子。六、测序验证展开1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做 PCR 喽，不过对于 PCR 的酶和 buffer ，不能用平时注意事项的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K,所以要用那些 GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。2. Qu

7、ick change 试剂盒分为几种不同的类型， QuikChange® 、Site-Directed Mutagenesis Kit 标准点突变试剂盒 、 QuikChange® 、 XL Site-Directed Mutagenesis Kit 长模板单点突 变试剂盒（ 8kb ）从原理上是一样的，只是 PCR 的酶和 BUFFER 不一样，后面用了比较适合 长片段扩增的酶和 BUFFER 罢了，没什么特别的东西。3. DpnI 处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理 得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

8、4. 实验板长出来的菌有两种可能， 一种是质粒 DPNI 没处理干净长出来的 （模板），一种是 PCR 产物转化出来的（突变体） ，不过这两种菌长得一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和 PCR 都无法区分），除了测序，是分不出来的。5. 做 PCR 时也最好做一个负对照（不加引物） ，实验管由于 PCR 时有引物，所以在 DNPI 处 理前里面既含有模板又含有 PCR 产物，而对照管由于 PCR 时没放引物，所以在 DPNI 处理前 里面只有模板。如果两者都拿去 DNPI 处理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的 话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是

9、DpnI 没处理好，如 果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是 PCR 阴性，也就是说 PCR 出问题了，另外一 个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那就做个转化的对照， 拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。一、经验分享1. 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一 般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出 来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配， 然后暴昏。其他大家实验室里面还

10、是用 Taq 酶为主吧， Pfu 这样的高保真酶大家应该用得不多吧， Taq 酶的优点 和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数 字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是 2000bp 的基因，如果扩四五十个循环的 话，很大机率会出现点突变， 当然这也跟具体 PCR 体系里的 Buffer 有很大关系， 详细情况这里 就不讨论了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚 型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的 一种思路吧。对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基

11、不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要， 大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变， 那么一般情况下也可以不去理它。另外，在 NCBI 上人类的基因的版本一直在变化，也就是说 同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来 的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR 然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU ，或者 PCR 循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了

12、。接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个 Stratagene 试剂盒！上面有一个说明书，说得好像 很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实 验方面，通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR 产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确 定就行了。2. 大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？对于第一个问题：怎么设计引物？我只能讲一些原则，并举一些例子。引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：不过这种突变引物

13、要加上一个原则：一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair 。若两边引物太短了， 很可能会造成突变实验失败， 大家应该都知道，引物至少要 11-12个 base pair 才能与模板搭上， 而这种突变 PCR 要求两边都能与引物搭上， 所以两边最好各设至少 12个 base pair ，并且合成多一条反向互补的引物。这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG960 现有序列 TATCAGGAGGAATTTG

14、AGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG924* *deletionX71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984*（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个 A 碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋 白时后面的氨基酸全部错配）我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的 A 造成引物 G

15、C% 含量过低，故拉长引物使 GC% 含量不至过低，也使引物退火温度升高。故合成引物 CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互补引物 CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于 12 个碱基，同时符合引物设计 的原则就行了。引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价 钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。这样的结果是 PCR 时把整个质粒都给扩出来了，得到的 PCR 产物是一条链完整，另一链有缺 刻的 PCR 产物对于第二个问题：怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用 DpnI 酶， DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们 用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除 非你用的是甲基化缺陷型的菌株） ，而 PCR 产物都是没有甲基化的， 所以 DpnI 酶能够特异性地 切割模板（质粒）而不会影响 PCR 产物，从而去掉模板留