血库技术操作规程

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1、ABO血型正定型操作规程1、 原理根据红细胞表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。可利用红细胞凝集试验，通过正定型鉴定ABO血型。正定型用已知抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或（和）B抗原。2、 试剂2.1 抗A、抗B血型定型试剂，有批文准号。2.2 受检者35%红细胞盐水悬液。3、 操作3.1 试管法3.1.1 取洁净小试管2支，分别标明抗A、抗B，用滴管分别滴加抗A、抗B分型试剂各一滴于试管底部，再用滴管分别加入受检者35%红细胞盐水悬液1滴混匀。3.1.2 立即以1000r/min离心1分钟。3.1.3 将试管从离心机取出，轻轻摇动试管，使

2、沉于管底的红细胞 浮起，先以肉眼观察有无凝集或溶血现象。如肉眼未见凝集，应将反应物倒于玻片上，以低倍镜观察。3.1.4 观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，此有助于 A、B亚型、类B或cisAB的发现。3.1.5 凝集强度判断标准 4+：红细胞凝集成一大块，血浆清晰透明。 3+：红细胞凝集成数小块，血浆尚清晰。 2+：红细胞凝块分散成数小块，周围可见到游离红细胞。 1+：肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞 ：镜下可见数个红细胞凝集在一起，周围有很多游离红细胞。MF：即混合凝集外观，是指镜下可见少数红细胞凝集，而绝大多数红细胞仍呈分散分布。：镜下未见凝集，红细胞均匀分布。3.2 玻片法

3、3.2.1 取清洁玻片一张（或凹玻板），用记号笔划成方格，标明抗A、抗B，分别滴加抗A、抗B血清一滴于相应的方格内，再加受检者5%红细胞悬液一滴混匀。3.2.2 将玻片（或凹玻板）不断轻轻转动，使血浆与细胞充分混匀，连续15分钟，肉眼观察有无凝集或溶血反应，再在低倍镜下观察结果。ABO血型反定型操作规程1、 原理用已知的A1、B细胞测定被箭血清中有无相应的抗A或抗B抗体，结合正定型结果判断ABO血型。2、 试剂为成熟市售标准红细胞，主要组成组分为：A1、B型红细胞，葡萄糖、枸橼酸、核苷酸、抗生素等。3、 样本要求被检血清或血浆。4、 操作（试管法）4.1 取被检者血清（血浆）各1滴分别加于2支

4、标记好的小试管中；4.2 分别各加A1、B试剂红细胞；4.3 混匀后离心，1000rmp离心1分钟或者3400rmp离心15秒；4.4 先观察是否溶血（溶血或是阳性结果，或是细菌污染），再轻轻摇晃，使红细胞再悬浮起来；4.5 观察是否有凝块，记录结果。如可疑可借助显微镜观察凝集情况。5、结果判断正定型反定型血型抗A试剂抗B试剂A1细胞B细胞+A+B+O+AB6、方法的局限性反定型试验必须与正定型一起进行，正反定型不一致必须做进一步研究。单独的反定型结果不能作为判断血型的依据。RHD(IgM)血型定型操作规程1、 原理应用红细胞凝集试验检测红细胞抗原。RH（D）血型是由红细胞表面存在或缺失D抗原

5、确定。RH血型用临床上抗原性最强的D抗原作血型鉴定，凡是带有D抗原者称为RH阳性，不带D抗原者称为RH阴性D抗原与细胞株BS226细胞产生的单克隆抗体发生特异性反应。2、 试剂市售成熟RHD(IgM)血型定型试剂。3、 样品要求应使用新鲜、非溶血标本，可以是未加抗凝剂的血液标本，或者是用EDTA或枸橼酸抗凝的血液标本。必要时应用等渗盐水加入经过洗涤两遍以上的红细胞悬液。严重脂血、黄疸或微生物污染过的标本可能导致结果判断错误。4、 操作4.1 试管法4.1.1 用等渗盐水配制35%的红细胞悬液；4.1.2 在相应标记好的试管中分别加1滴试剂和1滴红细胞悬液；4.1.3 1000rmp离心2分钟或

6、3000rmp离心20秒；4.1.4 轻轻震荡，悬浮沉积细胞，观察凝集结果；4.1.5 若反应为阴性、弱阳性或可疑，200C孵育15分钟；4.1.6 1000rmp离心2分钟或3000rmp离心20秒；4.1.7 轻轻震荡，悬浮沉积细胞，观察凝集结果；4.1.8 出现凝集为阳性，未出现凝集为阴性。4.2 纸卡法4.2.1 在一块纸卡凹孔中滴1滴试剂；4.2.2 加1滴等体积全血，混匀；4.2.3 轻摇纸卡，观察凝集结果；4.2.4 出现凝集为阳性，未出现凝集为阴性。5、结果判断反应强度凝集4+强反应，单一凝集块，无游离红细胞3+强反应，几个大的凝集块，无游离红细胞2+很多小的凝集块中混有大的凝

7、集块，无游离红细胞1+在游离红细胞背景下有很多小的凝集块肉眼可观察游离红细胞背景下的小凝集块，显微镜下可观察到很多小的凝集块均匀分布的红细胞悬液，不能观察到凝集的红细胞 如果凝集块轻轻摇动就分散开，则判读为阴性。推荐使用试管法。ABORhD血型定型试剂卡标准操作程序1、 准备工作微柱凝胶试剂卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（1825）平衡，再用专用离心机离 心5分钟。2、 检测标本的准备：2、1 红细胞悬液的制备：取被检者压积红细胞10微升，加入1.21.5毫升红细胞稀释液，外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。2、2 血清标本的制备：采集被检对象静脉血，放入含

8、兔脑粉或其它促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者静脉血采入无抗凝剂试管中，4放置 12小时，或37放置2小时后离心，2000r/min,10分钟，取上清（该上清不得有絮状物或沉淀）。3、 操作步骤3、1 将准备好的ABO.RhD血型定型试剂卡做好标记3、2 将待检者0.5%红细胞悬液分别加入第1至第4管中，每管50ul3、3 将待检者血清分别加入第5和第6管，每管50ul3、4 将已知的A型和B型红细胞0.5%浓度悬液或ABO血型反定型红细胞试剂，每管50ul分别加入第5和第6管3、5 即刻使用专用离心机离心，900rpm2分钟，1500rpm3分钟，取出肉眼判定结果4、 结果判定：4

9、、1 阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中，为阳性反应。4、2 阴性结果：被检红细胞抗原无相应的抗体结合，不出现特异性抗原抗体复合物，红细胞沉于微柱凝胶的尖底部。5、 血型判定：血型抗A抗B抗D阴性对照A细胞B细胞D阳性A +B +O+AB+D阴性 A +B+O+AB+6、注意事项6、1. 检测标本必须为抗凝血。6、2 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。尽可能应用当日采集的新鲜血做本试验。如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本实验。6、3. 血清标本：血清标本必须充分去纤维蛋白，否则

10、标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍阴性红细胞沉淀，呈假阳性反应。6、4. 如在微柱凝胶管中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。6、5. 若结果为或1需进一步分析，可能为亚型或弱化抗原。6、6. 红细胞悬液的浓度控制在0.50.8之间，否则可能出现漏检或混合凝集。6、7. 每日实验前，先取出微柱凝胶卡放置一段时间至室温，以防冷凝集。6、8. 试剂卡应放在18-25储存，如若长期放在4冰箱，建议每1-2个月取出，用专用离心机离心一次，以防止干胶或产生气泡。A型、B型红细胞悬液的制备1、 原理 离心力原理

11、2、 试剂 生理盐水3、 操作3.1 A型红细胞悬液和B型红细胞悬液的来源:从抗体亲和力强凝集效价较高的健康人采取。3.2 取五个健康者同型新鲜红细胞混匀,离心取血球100ul放入另一洁净干燥试管内。3.3 加生理盐水3ml,混匀后离心弃去上清液。3.4 重复上一步骤2次。4、 加生理盐水1.2ml,并做好A和B型红细胞标识和制备日期。抗A、B型血清效价测定1、 原理根据红细胞表面有无A抗原和（或）B抗原，将血型分为A型、B型、AB型及O型4种。可利用红细胞凝集试验，通过正反定型准确鉴定ABO血型。正定型用标准抗A和抗B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或（和）B抗原，根据稀释不同的滴度所

12、反应出来的凝集来判断该血浆的抗A和抗B血浆效价。2、 试剂2.1 抗A（B型血）、抗B（A型血）。都是有合格证件的商品。2.2 0.8%A、B型试剂红细胞悬液，是有合格证件的商品。3、 操作3.1 取10mm60mm清洁干燥试管16支，排成2排，分别标明A、B，每排标明稀释倍数2、4、8、16、32、64、128，最后一管为对照管。3.2 每管各加生理盐水0.2ml。3.3 第一排第一管加抗B 血清0.2 ml，第二排第一管加抗A血清0.2 ml。3.4 分别用吸管将第一管内溶液吸放3次，使之混匀，吸0.2 ml3.5 至第二管，因此连续稀释至第七管，混匀后弃去0.2 ml。第八管不加血清，作

13、为盐水对照。3.6 分别加入相应2%红细胞悬液0.2 ml，即第一排加B型红细胞悬液，第二排加A型红细胞悬液。3.7 将试管架振摇使之混匀，置1520室温1小时（或1000r/min离心1分钟），用肉眼观察结果，呈弱凝集反应的最高稀释倍数的倒数即为该抗体的效价。对照管应无凝集现象。3.8 抗A效价应不低于128，抗B效价应不低于64。抗D血清效价测定1、 原理RH血型用临床上抗原性最强的D抗原作血型鉴定，凡是带有D抗原者称为RH阳性，不带D抗原者称为RH阴性。根据稀释不同的滴度所反应出来的凝集来判断该血浆的抗D血清效价。2、 试剂生理盐水3、 操作3.1 取10mm60mm清洁干燥试管8管放在试管架上，排成1排，表明稀释倍数2、4、8、16、32、64、128，最后一管为对照管。3.2 每管各加生理盐水0.2 ml。3.3 第一管加抗D血清0.2 ml。3.4 分别用吸管将第一管内溶液吸放3次，使其混匀，洗0.2 ml至第二管，依次连续稀释至第七管，混匀后弃去0.2 ml。第八管不加血清，作为生理盐水对照。3.5 加入2%红细胞悬液0.2 ml。3.6 将试管架振摇使之混匀，置1520室温1小时（或1000r/