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1、土壤磷酸酶（酸性）一 酸苯二钠比色法（一）试剂1. PH5醋酸盐缓冲液：A:L醋酸溶液（稀释至1000ml）B:L醋酸钠溶液A液+B液稀释至100ml若使用无水乙酸及乙酸钠配制1升PH为的乙酸盐缓冲液，则需要无水乙酸及乙酸钠的量计算如下：无水乙酸用量的计算：无水乙酸的浓度为，则需无水乙酸的体积为X1000/=（毫升）；乙酸钠用量的计 算：查表知，无水乙酸钠的摩尔质量为82，则需无水乙酸钠的质量为X82X1=11 （克）使用无水乙酸及 乙酸钠配制1升PH为的乙酸盐缓冲液的方法如下：用量筒量取毫升无水乙酸至1000毫升烧杯内，再用 台秤称取无水乙酸钠11克至该烧杯，然后用量筒量取=996毫升蒸馏水
2、至该烧杯内，搅拌至乙酸钠溶解并 呈均匀的溶液即为1升PH为的乙酸-乙酸钠缓冲液。或者：量7ml醋酸钠液+3ml醋酸液混合即得。2. %磷酸苯二钠：pH5醋酸缓冲液3. 氯代二溴对苯醌亚胺：称取2，6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%乙醇（48ml 乙醇+2ml水）溶解，贮存于棕色瓶中，存放在冰箱中，保存的黄色溶液未变褐 色之前均可使用。4. 酚标准溶液：酚原液一-取1g苯酚溶于蒸馏水中，定容至1000ml水中，保存 于棕色瓶中。酚工作液一-取10 ml酚原液稀释至1000ml水中，每毫升含酚5. 甲苯硫酸铝溶液，称取硫酸铝，定容至100ml。（二）实验步骤1. 标线制作取0,1, 3, 5
3、, 7, 9, 11，13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，加入5ml缓冲 液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30mi n后比色测定。以 光密度值为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。2. 样品测定称取风干土样（过20目筛，去除杂质），放置于200ml容量瓶（离心管）中， 加甲苯，轻摇15min后，加入20ml %磷酸苯二钠，仔细摇匀后放置于37 C恒 温箱中培养24h,后于培养液中加入%硫酸铝溶液过滤。吸取滤液3ml于50ml比 色管中，按标准曲线方法显色，于波长578nm处测定颜色的深度，读取吸光值。 对每一土样，设置用10mL水代替磷酸苯二钠基质的对照。并作空白无土对照。
4、（三）数据计算以24小时每克土壤中释放出的酚的毫克数表示。土壤脲酶活性测定：靛酚比色法试验步骤：试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。3）柠檬酸盐缓冲液（）：184克柠檬酸和克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/L NaOH将PH调至，用水稀释至1000毫升。4）苯酚钠溶液（L）：A：克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升， 存于冰箱中；B： 27克NaOH溶于100毫升水，存于冰箱中。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100 毫升备用。5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为%，溶液稳
5、定。如购买的溶液是含10%活性氯的，则计算如下：10%*原液体积（配100ml）=% （100ml+需加水）6）氮的标准溶液：a精确称取克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有 氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml，加蒸馏水定容至100ml，吸取稀释的 标准液1, 3, 5, 7, 9，11，13ml，移至50ml容量瓶，加蒸馏水至20ml，再加 入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟后显色, 用水稀释至刻度。1h内将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定, 以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。1）称取10g
6、（5g）过20目筛的风干土样于100ml （50ml）三角瓶中。2）向容量瓶中加入2ml （1ml）甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分 钟。3）之后加入20ml （10ml） 10%尿素溶液和40ml （20ml）柠檬酸缓冲液（），并 仔细混合。4）将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中，培养24h5）培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤 纸过滤于三角瓶中。与此同时，进行以水代替基质（10ml 10%尿素用10ml蒸馏水 代替），及无土对照测定。6）显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，加入20ml （10ml）蒸馏水，充分震 荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混
7、合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置 20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现靛酚的蓝色。7）1h内在（靛酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm 处将显色液进行比色测定。8）无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实 验设置一个对照。9）无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都 设此对照。结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g 土壤中NH3 N的毫克数表示。M=（X样品一X无土一X无基质）*100*10式中：M 土壤脲酶活性值X样品一一样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3 N毫克数X无土一一无土对照实验中的
8、光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数X无基质一一无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3N毫克数100 样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 酶活性单位的土重与样品土重之比值若土壤脲酶活性以24小时后100g 土壤中NH3 N的毫克数表示的话，计算如下: M=a*2a样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3 N毫克数。2换算成1g 土的系数。土壤蔗糖还原酶测定方法酶促反应试剂：1）8%蔗糖溶液：称取8g蔗糖溶解，定容至100ml。2）磷酸缓冲液:1/15M磷酸氢二钠（2H20溶于1L蒸馏水）加1/15M磷酸二 氢钾（KH2P04溶于1L蒸馏水中）即成。3）甲苯4）3,5-二硝
9、基水杨酸试剂（DNS试剂）：称二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L NaOH 和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释定容至100ml（保存期不过7天。三、操作步骤（1）标准曲线绘制：将葡萄糖现在50-58C条件下真空干燥至恒重，然后称取 500mg溶于100ml苯甲酸溶液中（5mg还原糖/ml）,即成标准葡萄糖标液。吸 5mg/mL的标准葡糖糖溶液10m1于100ml容量瓶中，定容。从中吸取0、2、 3m1于50m1容量瓶，加DNS试剂3mL混匀,于沸水浴中准确反应5mi n （从试管放入 重新沸腾时算起），取出立即冷水浴中冷却至室温，定容。即为浓度为0ppm、2ppm、 4ppm
10、、8ppm12ppm、15ppm、20ppm、30ppm的标准曲线。以空白管调零在波长508nm 处比色，以0D值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。（2）土壤蔗糖酶测定称取土壤，置于100mL容量瓶中，注入30ml 8%蔗糖溶液,磷酸缓冲液和1m1甲苯。 摇匀混合物后，放入恒温箱，在37C下培养24h。到时取出，迅速过滤。从中吸取 滤液2-10ml （1ml）（适量，无蔗糖对照吸取20m1）,注入50ml容量瓶中，加3m1DNS 试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5mi n,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3mi n。 溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50m1
11、，并在 分光光度计上于508mm处进行比色。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引 起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照:如果样品吸光值 超标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。)(3) 结果计算：蔗糖酶活性以24h后1g 土壤葡萄糖的毫克数表示。葡萄糖(毫克)=a*4a代表从标准曲线查到的葡萄糖毫克数4代表换算成1克土的系数过氧化氢酶活性测定一容量法1. 试剂配制过氧化氢溶液:将10m130%的过氧化氢用水稀释至1L,此溶液不稳定,需临时配1111置。硫酸:浓硫酸溶于水，再用蒸馏水稀释至100mlKMnO4溶液:称取化学纯高锰酸钾，溶于1升蒸馏水中,贮于棕色瓶
12、中，备用。如 果知道酶活性很高的话可以适当变化高锰酸钾浓度2. 操作步骤取5g (2g)过1mm风于土，置于150mL (100ml)三角瓶中，并注入10mL (40ml) 蒸馏水和 H2O2溶液。同时设置对照，即三角瓶中注入10mL蒸馏水和5mL %过氧化氢溶液,而不加土 样，并作无士对照。(3)将三角瓶放在振荡机振荡(120r/mi n)30min后，加入5mL L硫酸，以稳定未分 解的过氧化氢，再将瓶中是悬液用慢速型滤纸过滤，吸取25mL滤液，用L高锰酸 钾滴定至淡粉色终点。(30s不退色)3. 结果计算以单位土重消耗的L高锰酸钾毫升数(对照与试验测定的差)表示土壤过氧化氢 酶活性，其计
13、算式为：土壤过氧化氢酶活性(ml KMn04/g干土) = (V0-V)/m式中，VO:为滴定空白(25ml过氧化氢)所消耗的高锰酸钾毫升数(ml)V:为滴定试样所消耗的高锰酸钾毫升数(ml)m为烘干土壤重量(g)或者：30mi n后1g 土壤过氧化氢酶活性二(VO-V)*T (T为高锰酸钾滴定度的校正值)高锰酸钾溶液标定:吸取2m1草酸钠标准液(称取草酸钠溶于1000ml水即可。 于200ml三角瓶中，并加水至80ml左右，投入几粒玻璃珠，再加5m1 1:3的硫酸酸 化,在电炉上加热2mi n,取下稍冷，趁热(70-80度)用高锰酸钾溶液滴定，滴为红 色(30s不退色)即达到终点，记下高锰酸钾的毫升数(V)。高锰酸钾溶液标准浓度 按下式计算 c(1/5MnO4)=m/(V1-V2)*
