根尖压片技术

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1、根尖压片技术原理：在细胞分裂周期中，核内遗传物质染色体会呈现规律性的变化，通过固定、染色和 压片，在显微镜下可观察到有丝分裂各时期的细胞和染色体。材料准备(材料培养-剪取根尖)1、预处理秋水仙碱0.01-0.05%1-4小时(可阻碍纺锤丝的形成，染色体变粗而平直，分散度好，便于 记数)2、固定：采用化学试剂迅速杀死细胞，保持细胞内部的原有结构，并对以后的染色体和压 片没有影响的方法。(卡偌固定液：乙醇：冰醋酸=3： 1)低温下2-24小时。3、保存：70%乙醇操作程序浓盐酸：乙醇=1： 1蒸馏水切成几块解离漂洗选取根尖分生组织染色室温下5-6分钟改良液1-2滴盖片一-敲片一-烤片一-压片一-镜

2、检一-石蜡封片一-标签5分钟植物染色体压片法一、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定， 经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的 细胞和染色体。二、实验目的根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、 染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。三、实验材料大蒜(Aillumsativum)、洋葱(Aillumcepa)的鳞基或蚕豆(Viciafaba) 的种子。四、实验器具和药品1. 用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子， 解剖针，毛边纸。2. 药品：无水酒精，70%酒精

3、，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱 性品红，石碳酸，甲醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal）， 二甲苯。卡诺固定液的配制：用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）。酶液的配制：以0.1mol/L醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶（2% ）和果胶酶 （0.5%）的混和液。染色液的配制：配方I.石碳酸品红（Carbol.fuchsin），先配母液A和B。母液A：称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70%酒精中（此液可长期保 存）。母液B：取母液A10毫升，加入90毫升的5%石碳酸水溶液（2周内使用）。石碳酸品红染色液：取母液B45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的 甲

4、醛。此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较 适宜，后来在此基础上，加以改良的配方II，称改良石碳酸品红，可以普遍应用 于植物染色体的压片技术。配方II：改良石碳酸品红取配方I .石碳酸品红染色液210毫升，加入9098毫升45%的醋酸和 1.8克山梨醇（sorbitol）。此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能 力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。五、实验说明1. 根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以 发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。2. 植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显 地影响分裂

5、周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握 有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。3. 前处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成， 让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理34 小时。可处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。4. 解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解， 使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。（1）酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体 计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单 细胞，但是大部分分裂

6、细胞的染色体还包在细胞壁中间。（2）酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解 离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片， 使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，致使多项制片措施直接作用于染 色体。六、实验步骤（一）将大蒜或洋葱的鳞基，置于盛水的小烧杯上，放在25C温箱中，待 根长到2cm左右时，在上午九时摘下根尖，放到对二氯苯饱和水溶液，或0.02% 秋水仙素溶液中，浸泡处理34小时。（二）经过前处理的根尖，再放到卡诺固定液中，固定24小时。固定材料 可以转入70%酒精中，在4C冰箱中保存，保存时间最好不超过二个月。（三）这里介绍两个解离方法

7、，可以根据实验需要选择使用。1. 酸解：从固定液中取出大蒜或洋葱根尖，用蒸馏水漂洗，再放到 0.1mol/LHCl中，在60C水浴中解离810分钟，用蒸馏水漂洗后，放在染色板 上，加上几滴改良石碳酸品红染色液，根尖着色后即可压片观察。2. 酶解：取大蒜或洋葱的固定根尖，放在0.1mol/L醋酸钠中漂洗，用刀片 切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把根尖分生组织切成23片）， 把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶（2%）和果胶酶（0.5%）的混合液 中，在28C温箱中解离45小时，此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔 软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上0.1mol/L醋酸钠，使

8、组织中 的酶液渐渐渗出，再换入45%醋酸。酶解后的根尖，如作分带或姊妹染色单体交换，可用45%醋酸压片，如作 核型分析或染色体计数等常规压片，可放在改良石碳酸品红中染色，经过酶处理 的组织染色速度快。（四）压片，把染色后的根尖放在清洁的载玻片上，用解剖针把根冠及延长 区部分截去，加上少量染色液，并盖上盖玻片。一个解离良好的材料，只要用镊 子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多 余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻 轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相，要达到这个目的， 必需掌握以下几点：1.压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。2.用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，使个别染色体 丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。（五）封片。把压好的玻片标本，放在十冰或冰箱结冰器里冻结。然后用刀 片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片 封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。七、结果拍摄根尖染色体的分裂相。