根尖压片技术

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1、根尖压片技术原理:在细胞分裂周期中,核内遗传物质染色体会呈现规律性的变化,通过固定、染色和 压片,在显微镜下可观察到有丝分裂各时期的细胞和染色体。材料准备(材料培养-剪取根尖)1、预处理秋水仙碱0.01-0.05%1-4小时(可阻碍纺锤丝的形成,染色体变粗而平直,分散度好,便于 记数)2、固定:采用化学试剂迅速杀死细胞,保持细胞内部的原有结构,并对以后的染色体和压 片没有影响的方法。(卡偌固定液:乙醇:冰醋酸=3: 1)低温下2-24小时。3、保存:70%乙醇操作程序浓盐酸:乙醇=1: 1蒸馏水切成几块解离漂洗选取根尖分生组织染色室温下5-6分钟改良液1-2滴盖片一-敲片一-烤片一-压片一-镜

2、检一-石蜡封片一-标签5分钟植物染色体压片法一、实验原理植物根尖的分生细胞的有丝分裂,每天都有分裂高峰时间,此时把根尖固定, 经过染色和压片,再置放在显微镜下观察,可以看到大量处于有丝分裂各时期的 细胞和染色体。二、实验目的根尖染色体压片法,是观察植物染色体最常用的方法,也是研究染色体组型、 染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。三、实验材料大蒜(Aillumsativum)、洋葱(Aillumcepa)的鳞基或蚕豆(Viciafaba) 的种子。四、实验器具和药品1. 用具:染色板,载玻片,盖玻片,指管,温度计,试剂瓶,滴瓶,镊子, 解剖针,毛边纸。2. 药品:无水酒精,70%酒精

3、,冰醋酸,对二氯苯或秋水仙素,醋酸钠,碱 性品红,石碳酸,甲醛,山梨醇,纤维素酶,果胶酶,中性树胶或油派胶(Euparal), 二甲苯。卡诺固定液的配制:用3份无水酒精,加入1份冰醋酸(现配现用)。酶液的配制:以0.1mol/L醋酸钠为溶剂,配成纤维素酶(2% )和果胶酶 (0.5%)的混和液。染色液的配制:配方I.石碳酸品红(Carbol.fuchsin),先配母液A和B。母液A:称取3克碱性品红,溶解于100毫升的70%酒精中(此液可长期保 存)。母液B:取母液A10毫升,加入90毫升的5%石碳酸水溶液(2周内使用)。石碳酸品红染色液:取母液B45毫升,加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的 甲

4、醛。此染色液含有较多的甲醛,在植物原生质体培养过程中,观察核分裂比较 适宜,后来在此基础上,加以改良的配方II,称改良石碳酸品红,可以普遍应用 于植物染色体的压片技术。配方II:改良石碳酸品红取配方I .石碳酸品红染色液210毫升,加入9098毫升45%的醋酸和 1.8克山梨醇(sorbitol)。此染色液初配好时颜色较浅,放置二周后,染色能 力显著增强,在室温下不产生沉淀而较稳定。五、实验说明1. 根尖由于取材方便,是观察植物染色体最常用的材料,有些植物种子难以 发芽,或仅有植株而无种子,也可以用茎尖作为材料。2. 植物细胞分裂周期的长短不尽相同,通常在十到几十小时之间,温度明显 地影响分裂

5、周期,对于一个不太熟悉的实验材料,最好在特定温度下长根,掌握 有丝分裂高峰期,以便得到更多的有丝分裂的细胞。3. 前处理的目的是降低细胞质的粘度,使染色体缩短分散,防止纺锤体形成, 让更多的细胞处于分裂中期,一般在分裂高峰前,把根尖放到药剂中处理34 小时。可处理的药剂很多,如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。4. 解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解,细胞壁软化或部分分解, 使细胞和染色体容易分散压平,解离方法有酸解法和酶解法。(1)酸解法是用盐酸水解根尖,步骤简便、容易掌握,广泛应用于染色体 计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后,都呈单 细胞,但是大部分分裂

6、细胞的染色体还包在细胞壁中间。(2)酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究,通过解 离和压片,使分生细胞的原生质体,能够从细胞壁里压出,再经过精心的压片, 使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质,致使多项制片措施直接作用于染 色体。六、实验步骤(一)将大蒜或洋葱的鳞基,置于盛水的小烧杯上,放在25C温箱中,待 根长到2cm左右时,在上午九时摘下根尖,放到对二氯苯饱和水溶液,或0.02% 秋水仙素溶液中,浸泡处理34小时。(二)经过前处理的根尖,再放到卡诺固定液中,固定24小时。固定材料 可以转入70%酒精中,在4C冰箱中保存,保存时间最好不超过二个月。(三)这里介绍两个解离方法

7、,可以根据实验需要选择使用。1. 酸解:从固定液中取出大蒜或洋葱根尖,用蒸馏水漂洗,再放到 0.1mol/LHCl中,在60C水浴中解离810分钟,用蒸馏水漂洗后,放在染色板 上,加上几滴改良石碳酸品红染色液,根尖着色后即可压片观察。2. 酶解:取大蒜或洋葱的固定根尖,放在0.1mol/L醋酸钠中漂洗,用刀片 切除根冠以及延长区(根尖较粗的蚕豆,可以把根尖分生组织切成23片), 把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶(2%)和果胶酶(0.5%)的混合液 中,在28C温箱中解离45小时,此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色,质地柔 软而仍可用镊子夹起,用滴管将酶液吸掉,再滴上0.1mol/L醋酸钠,使

8、组织中 的酶液渐渐渗出,再换入45%醋酸。酶解后的根尖,如作分带或姊妹染色单体交换,可用45%醋酸压片,如作 核型分析或染色体计数等常规压片,可放在改良石碳酸品红中染色,经过酶处理 的组织染色速度快。(四)压片,把染色后的根尖放在清洁的载玻片上,用解剖针把根冠及延长 区部分截去,加上少量染色液,并盖上盖玻片。一个解离良好的材料,只要用镊 子尖轻轻的敲打盖玻片,分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层,再用毛边纸把多 余的染色液吸干,经显微镜检查后,选择理想的分裂细胞,再在这个细胞附近轻 轻敲打,使重叠的染色体渐渐分散,就能得到理想的分裂相,要达到这个目的, 必需掌握以下几点:1.压片材料要少,避免细胞紧贴在一起,致使细胞和染色体没有伸展的余地。2.用镊子敲打盖玻片时,用力要均匀,若在压片时稍不留意,使个别染色体 丢失,而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。(五)封片。把压好的玻片标本,放在十冰或冰箱结冰器里冻结。然后用刀 片迅速把盖玻片和载玻片分开,用电吹风把玻片吹干后,滴上油派胶加上盖玻片 封片,或经二甲苯透明后,滴中性树胶,加盖玻片封片,做成永久封片。七、结果拍摄根尖染色体的分裂相。

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