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1、金鱼草植株再生体系的建立1、金鱼草高效转化途径为1：余迪求,邓庆丽等人曾采用金鱼草下胚轴为外植体，建立不定芽发生系统，并在此基础上 进一步以下胚轴为转化受体进行农杆菌 Ti 质粒介导法将外源基因导人金鱼草细胞，成功地 获得开花的转基因植株2-4。由于金鱼草的无菌苗生长势极弱，从而导致以下胚轴为外植体 进行农杆菌 Ti 质粒介导法进行基因转化时，因下胚轴太小太细，在操作时往往将其伤害严 重，再加上农杆菌的侵染作用，外植体的共培养阶段几乎全部死亡，从而使再生率和转化率 大大下降，为金鱼草的基因转化工作增加了难度。因此，本实验研究所采取的金鱼草植株再生体系参照黄俊轩，李建科等人的方法如下：挑选饱满的
2、金鱼草种子，经消毒处理后得到无菌苗切取无菌苗下胚轴接种到MS+2.0mg/L BA+0.2 mg/L NAA分化培养基上诱导出再生芽将下胚轴再生的芽接种到增粗培养基1/2MS+1.0mg/L BA+0.2 mg/L IAA上，得到长势粗壮的金鱼草组培苗7以组培苗茎段为金鱼草基因转化的外植体进行遗传转化，转化所用的 诱导再生培养基为MS+2.0mg/L BA+0.2 mg/L NAA2、消毒、培养无菌苗的具体步骤：种子用70 %酒精浸泡2 min ,用含10 %次氯酸钠的0.5 %SDS灭菌5 min ,再用无菌水冲洗45次后，接种在MS基本培养基+3 %蔗糖+0.8 %琼脂的固体培养基上。培养
3、温度201 C,每天光照14 h ,光照强度1 600 lx ,以准备无菌苗。（姜维梅、梁海曼等）3、MS 培养基的配置：1、配制几种母液（1）配制 MS 大量元素母液一般将大量元素分别配制成20倍的母液，使用时再稀释20倍。分别称取名称重量名称重量NHNO4333gKHPO423.4gKNO338gCaCl 2H O228.8g（单独一瓶）MgSO 7H O7.4g各自配成1L的母液。各自倒入1L试剂瓶中，存放于4C冰箱中。2）配制 MS 微量元素母液一般将微量元素配制成 100 倍母液。依次称取（注：溶好-个后，再加下一个）名称重量名称重量KI0.083gNaMoO242H O20.025
4、gHBO330.62gCuSO 45H O20.0025gMnSO H O421.69gCoCl 26H O20.0025gZnSO 7H O0.86g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。注：CuSO5H O和CoCl6H O由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。4222分别称取 CuSO 5H O 0.5g, CoCl 6H O 0.5g4222各自配成 100ml 的调整液，然后取 500ul 就还有 0.0025g 的量。（3）配制 MS 有机母液一般配制成 100倍 MS 有机母液。依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）名称重量名称重量肌醇10g盐酸
5、硫胺素（VB1）0.01g烟酸0.05g甘氨酸0.2g盐酸吡哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。4）配制 MS 铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。依次称取EDTA二钠3.73g,FeS047屯0 2.78g （注：溶好一个后，再加下一个） 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。5）激素母液的配制各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95% 的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水 定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培养基以配置1L MS培养基为例，按顺序进
6、行如下操作：（1）先在烧杯中放入一些（约800m 1）蒸馏水。（ 2） 分别取上面母液按所需稀释的倍数吸取对应的体积数倒入。（3）一般称取30g蔗糖（scurose）倒入，搅拌溶解。（4）加蒸馏水用量筒定溶至 1L。（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长 至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确）可 配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。1当量HCL配制：用量筒量取& 3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制：称取NaOH 4g配成10
7、0ml溶液。（7）称取质量分数0.5%左右琼脂粉（Agar），倒入分装的各个试剂瓶中。（8）将定容好的 MS 溶液分装入各个试剂瓶中（用量筒、量杯）用封口膜或牛皮纸封口， 用橡皮筋或绳子扎紧。（9）放入消毒灭菌锅1219灭菌，灭菌20分钟左右。（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却40-509左右，在超净台 上分装到每个组培瓶中 40ml 左右。4、目前实验进展：2 0 1 4年7月1 5日购买金鱼草种子1 0 0颗，其中有50颗用来直接种植，观察出芽率。 发现出芽率只有30-40%左右，剩下50颗于2014年7月26日用来培养金鱼草的无菌苗。培养无菌苗的具体方法：种子在经
8、上述方法消毒、灭菌冲洗后，分别在每个装有基础MS培 养基的组培瓶中，点种金鱼草种子4颗，间隔分开种子落在培养基的表面，瓶口封好封口膜， 放置光照恒温培养箱中培养。光照14小时，黑暗10小时，恒温21-22度。一共培养12瓶。经过15-16天的培养后，共发芽并得到无菌苗23颗，其中一瓶染菌2颗，这样可用金 鱼草无菌苗共21颗，长势良好，株高2-3cm左右。分化培养基已经配好，分装到60个组培瓶中，分别取无菌苗的上胚轴、中胚轴、下胚 轴，切取1-2cm左右，每个瓶中培养一个胚轴,培养基为分化培养基:MS+2.0mg/L BA+0.2 mg/LNAA,诱导出再生芽，生长16-18天左右后，统计再生率。参考文献1 黄俊轩，李双跃，李建科等金鱼草高效植株再生体系的建立J.安徽农业科学，2007, 35(20)：6039-60402 余迪求，邓庆丽，沈亚楠等金鱼草下胚轴组织培养的研究J.田园艺学报， 1996(23):99-100.3 余迪求，邓庆丽，沈亚楠等.金鱼草基因转化和转基因植株再生J.热带亚热带植物学 报， 1996 ，4(4):86-90.4 姜维梅，梁海曼,种华鑫.金鱼草下胚轴不同部位切段形态发生能力的研究J.云南植物 研究， 1999，21(1):109-11.5 李竹英，钱艳红，毛绍春.不同激素对金鱼草茎尖组织培养效果初探J.北方园艺，2006 (3)：130131.
