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1、角质形成细胞的原代培养方法作者：acne译 来源：丁香园 时间：2007-3-3实验仪器大全实验试剂大全细胞培养(Cell Culture)专题：http:/ask.bbio o com/special/experiment/cellculture htm人角质形成细胞培养方法A. 从新生儿包皮分离出表皮角质形成细胞1. 在包皮环切术中，包皮放置于含有庆大霉素(Cat.No.15710)(浓度为5ug/ml)的 Dk-SFMZ中。包皮可保存于289直到需要使用时。(注意：人类包皮可以保存于此种 物质中289约5天而不会明显失去细胞活性。)2. 包皮放置于含有庆大霉素(浓度为20ug/ml)的D
2、PBS (不含Ca2+ or Mg2+ ) (Cat.No.14190)冲洗液中约1小时。包皮剪成24块并转移到酪蛋白溶解的25.0单位/ml的dispase (Cat.No.17105) DPBS溶液中(添加5ug/ml的庆大霉素)，在28C条 件下孵育18小时。3. dispase 孵育后，人角质形成细胞的表皮层从真皮层分离下来，转移到加有510ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA (Cat.No.25300)的 60mm 有盖培养皿中。在 36C 2C 条件下孵育大约 15 分钟，在这个过程中，每23 分钟使用 2ml 的移液管吹打以帮助 细胞解离。4. 孵育以后，胰蛋白酶活
3、性使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Cat.No.17075)终止，大豆 胰酶抑制剂终浓度为10mg/ml使用DPBS (不含Ca2+ or Mg2+ )配置，并在使用前无菌过 滤。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按 上述方法再次离心。5. 角质形成细胞使用 5ml 完全培养基轻柔的吹打成悬液，并使用血细胞计数器计算角质形 成细胞浓度。原代细胞大约3x106放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。 细胞培养：松弛的瓶盖，36C 士 2C，5% CO2的潮湿空气中。6. 角质形成细胞培养液约每23天更换一次。7. 由于原代角质形成细胞在供
4、者之间生长特性的差异性，原代培养可能需要610天才能 达到 60%75%的融合。B. 人表皮角质形成细胞的传代1. 达到60%75%的融合后，移去培养基，单层细胞使用10ml 1： 5000乙二胺四乙酸(Versene)冲洗。12ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培养瓶中在36C 士 2C孵 育5-10分钟。当细胞开始变圆时，移除胰蛋白酶，在36C 士 2C再次孵育。2. 当大约90%细胞分离时，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。细胞悬液 转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次 离心。3. 角质形成细胞使用35ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，细胞大约13x106放入 75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。4. 细胞培养：36C 士 2C，5% CO2的空气中。角质形成细胞培养液约每23天更换一 次，当达到60%75%融合后，即可进行传代。
