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1、细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2) 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细
2、胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为25mg/ml。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 1mg/ml。结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:期的
3、细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;b期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。3 透射电子显微镜观察结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);a期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡
4、的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。方法 1 悬浮细胞的染色
5、:将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.51106)用PBS洗2次,加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10ul,室温避光30min,再加入PI(50ug/ml)5ul,避光反应5min后,加入400ul Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h), 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2 贴壁培养的细胞染色:先用0.25%的胰酶消化,洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3 爬片细胞染色:同上,最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 图4、图5注意事项 1.
6、 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。三、线粒体膜势能的检测线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用,多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡,而线粒体跨膜电位DYmt的下降,被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件,它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前,一旦线粒体DYmt崩溃,则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在,使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine 123、3,3-Dihexyloxacarbocyanine iodideDiOC6(3)、Tetrechloro-tetraethylbenzim
7、idazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。方法:将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine 123(1mM)或终浓度为DiOC6(25nM),JC-1(1mM),TMRM(100nM),37C平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强度。注意事项1 始终保持平衡染液中pH值的一致性,因为pH值的变化将影响膜电位。2 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白,他们将与部分染料结合,降低染料的浓度,引起假
8、去极化。四、DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50300kbp长的DNA大片段, 或180200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后,采用常规方法分离提纯DNA,进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色,在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。1. 大分子染色体DNA片段的测定细胞凋亡的早期
9、,染色体断裂成为50300kbp长的DNA大片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶半径时,即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的大小来筛分DNA,DNA像通过弯管一样,以其一端指向电场一极而通过凝胶,这种迁移模式称之为爬行。因此,细胞凋亡早期产生的50300kbp长的DNA大片段不能用普通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变脉冲电场。每当电场方向改变后,大的DNA分子便滞流在爬行管中,直至新的电场轴向重新定向后,才能继续向前移动。DNA分子量越大,这种重排所需要的
10、时间就越长。当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时,DNA就可以按其分子量大小分开。参考文献 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-30392 DNA Ladder 测定方法:收获细胞(1107)沉淀?细胞裂解液?13000rpm5min, 收集上清?1%SDS
11、和RnaseA(5mg/ml)56C,2h?蛋白酶K(2.5mg/ml)37C,2h?1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA,4C过夜?14000rpm15min?最后将沉淀溶解在TE buffer中,加DNA Loading Buffer?1.2%琼脂糖凝胶电泳,EB染色并照相。结果:图6参考文献 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:55
12、06-55073 凋亡细胞DNA含量的流式细胞计分析方法:收集细胞?70%冷乙醇(in PBS)4C固定过夜?PBS洗涤,1000rpm10min?RNase A(0.5mg/ml)37C消化30min?PI(50mg/ml)染色,室温避光15min?FACScan分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化。结果:图74. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)优点:敏感度高,适合于检测少量样本,小部分凋亡细胞。如临床活组织检测。五 TUNEL法细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(Td
13、T)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3-OH形成,很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组
14、织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。 六、Caspase-3活性的检测 Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。1 Western blot 分析Pr
15、ocaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶poly(ADP-ribose)polymerase,PARP等的裂解。方法:收集细胞PBS洗涤抽提细胞裂解液蛋白定量SDS-PAGE电泳硝酸纤维素膜或PVDF膜转移5%脱脂奶粉封闭,室温1.52h或4C过夜Caspase-3多抗或单抗室温反应12h或4C过夜TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次,510min/次HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应12h TBS-T洗3次, 510min/次?ECL显影或NBT/BCIP显色。结果:图8-1、图8-22 荧光分光光度计分析原理:活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物,水解D4-X肽键。根据这一特点,设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小,可以测定caspase-3的活性,从而反映Caspase-3被活化的程度。方法:收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解