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1、流式细胞仪检测HLA-B27及其临床意义 摘要:目的通过流式细胞术对人体外周血HLA-B27的检测,来评价HLA-B27辅助临床诊断强直性脊柱炎(AS)的应用价值。方法56例强直性脊柱炎患者和51例健康体检者,用荧光标记的抗HLA-B27/CD3单克隆抗体与其外周血(以EDTA-K2抗凝)特异性结合,用流式细胞仪检测其荧光强度来反映细胞表面HLA-B27抗原的表达。结果从流式细胞术检测显示,56例AS患者中,HLA-B27阳性51例,阳性率为91.1%;51例健康体检者中,HLA-B27阳性3例,阳性率为5.9%。两者存在显著性差异,P0.01。结论AS患者HLA-B27阳性率明显高于正常人,
2、所以检测HLA-B27对强直性脊柱炎的诊断与鉴别诊断有着重要的意义。 关键词:流式细胞仪;强直性脊柱炎;HLA-B27B27是HLA-B27位点上的一个重要的等位基因,其与许多疾病具有相关性,尤其是强直性脊柱炎;而且这种相关是迄今为止已知的HLA与疾病的关联中最强和最典型的。目前,检测HLA-B27的主要方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试验、玫瑰花法、ELISA法、流式细胞术、PCR法等。其中以标准的NIH微量细胞毒法最为常用,这种方法操作简便且准确性尚可,但是受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性的影响,易出现漏诊或假阳性(错判、误判)1。现在我们用荧光标记的单克隆抗体与人类白细胞表
3、面抗原HLA-B27结合,用流式细胞仪来检测其细胞表面的HLA-B27表达,现报告如下: 1资料与方法 1.1 一般资料 1.1.1标本来源107例该院骨科门诊及住院确诊为AS的患者和健康体检者。其中经临床检查和影像学检查符合AS的患者56例,男38例,女18例,年龄1877岁。健康体检者51例,男27例,女24例,年龄2382岁。取上述人员静脉血2ml,EDTA-K2抗凝。 1.1.2 试剂美国Becton Dickinson公司HLA-B27 kit: HLA-B27-FITC (Clone GS145.2,IgG1 kappa);CD3-PE(CloneSK7,IgG1 kappa);H
4、LA-B27 Calibration Bead;溶血剂(Lysing solution1ys S) 批号为340183,洗涤液及鞘液用Coulter Isoton II血细胞稀释液 批号为 8546733。 1.1.3 仪器美国Beckman CoulterEPICSXL-MCL型流式细胞仪 1.2方法 1.2.1 标本处理取HLA-B27-FITC/CD3-PE荧光抗体30ul、全血样本50ul加入流式专用试管底部,混匀,置于室温避光15min。加10倍稀释后的溶血剂2ml,混匀,避光15min。1500r/min离心5min。弃上清液后用0.01N PBS洗涤两次,上机测定。 1.2.2检
5、测与结果判断流式细胞仪校正使用Beckman Coulter公司的FLOW-CHECK校准光路 样本检测 取标准荧光微球1滴Calibration Bead,用1ml蒸馏水稀释,测到一标准峰。分析已经处理好的样本,选取以CD3-PE标记的淋巴细胞,并检测这群细胞HLA-B27的中间荧光强度(Mdx),若中间荧光强度大于标准微球峰荧光强度即为阳性,反之则为阴性 2结果 HLA-B27在强直性脊炎患者(AS)和健康体检者中检测结果如下:临床诊断:AS患者例数:56例。阳性例数:51例。阳性率为91.1%,健康体检者 例数:51例。阳性例数:3例。阳性率为5.9% 从上述结果可以看出,AS患者HLA
6、-B27的阳性率高于健康体检者的阳性率。 3讨论 强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis,AS)是一种慢性、进行性和炎性疾病,主要累及骶骼关节、脊柱、脊柱软组织及四肢关节,主要症状是腰、骶及下肢关节疼痛,晚期患者脊柱僵硬呈板状,活动受限。HLA-B27与 AS 发病呈高度相关,其相关性为目前已知的HLA与疾病关系中关联性最强和最典型的一种2。有研究表明,HLA-B27检测可提高 X 线诊断AS 的阳性率,对AS早期尤其是X线表现不典型时具有良好的临床应用价值3。 本实验结果提示AS患者HLA-B27阳性率显著高于正常人阳性率,但HLA-B27阳性不能诊断随机选择患者是否患有
7、AS,因为非AS患者也有3%7%的阳性率,但当临床症状体征及影像学检查怀疑有AS时HLA-B27阳性可作为诊断指标。如某患者诊断AS的可能性为50,若患者阳性,则诊断AS的概率提高到95左右;若该患者HLA-B27阴性,则患AS的概率降至3左右。AS患者的临床症状与类风湿性关节炎有相似之处,因此对确诊为类风湿性关节炎的患者要进行B27的检测,以免漏诊。少儿患者因骶髂关节骨后未闭合,也给炎症程度的判断造成困难。所以,AS从发病到明确诊断往往需几年时间。而B27检测可以弥补上述不足,因此B27检测可作为AS的筛选方法。 过去使用的血清学方法存在许多不足:要求用血量大,需无菌分离淋巴细胞,而且分离的
8、淋巴细胞要有足够的活性。所用抗血清为多克隆抗体,特异性较差,实验不易标准化,分析所需时间较长,判断通过记数死亡的淋巴细胞的方法,常含主观人为因素影响。本实验应用流式细胞术,根据直接荧光染色的原理,通过双色直接免疫荧光单克隆抗体试剂抗HLA-B27-FITCCD3-PE与成人外周血淋巴细胞特异性结合,使细胞具有一定的荧光强度,这种荧光强度可被流式细胞仪测得,从而判断HLA-B27抗原阳性或阴性,同时可以根据荧光强弱的大小来进行判断HLA-B27的表达情况,具有快速、简单、特异性高的优点。 参考文献: 1李维,府伟灵.流式细胞术检测98例献血者外周血HLA-B27的临床意义J. 第三军医大学学报第,25(8):727-729. 2焦敏,侯卫红.HLA-B27与强直性脊柱炎的相关性研究进展J.中国优生与遗传杂志,2011,19(4):6-8. 3巫翠萍,覃西,赵莲.HLA-B27在诊断早期强直性脊椎炎中的应用价值J.海南医学,2011,22(23):19-21. 编辑/孙杰