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1、流式细胞仪检测HLA-B27及其临床意义 摘要：目的通过流式细胞术对人体外周血HLA-B27的检测，来评价HLA-B27辅助临床诊断强直性脊柱炎（AS）的应用价值。方法56例强直性脊柱炎患者和51例健康体检者，用荧光标记的抗HLA-B27/CD3单克隆抗体与其外周血（以EDTA-K2抗凝）特异性结合,用流式细胞仪检测其荧光强度来反映细胞表面HLA-B27抗原的表达。结果从流式细胞术检测显示，56例AS患者中，HLA-B27阳性51例，阳性率为91.1%；51例健康体检者中，HLA-B27阳性3例，阳性率为5.9%。两者存在显著性差异，P0.01。结论AS患者HLA-B27阳性率明显高于正常人，
2、所以检测HLA-B27对强直性脊柱炎的诊断与鉴别诊断有着重要的意义。 关键词：流式细胞仪；强直性脊柱炎；HLA-B27B27是HLA-B27位点上的一个重要的等位基因，其与许多疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎；而且这种相关是迄今为止已知的HLA与疾病的关联中最强和最典型的。目前，检测HLA-B27的主要方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试验、玫瑰花法、ELISA法、流式细胞术、PCR法等。其中以标准的NIH微量细胞毒法最为常用，这种方法操作简便且准确性尚可，但是受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性的影响，易出现漏诊或假阳性(错判、误判)1。现在我们用荧光标记的单克隆抗体与人类白细胞表
3、面抗原HLA-B27结合，用流式细胞仪来检测其细胞表面的HLA-B27表达，现报告如下： 1资料与方法 1.1 一般资料 1.1.1标本来源107例该院骨科门诊及住院确诊为AS的患者和健康体检者。其中经临床检查和影像学检查符合AS的患者56例，男38例，女18例，年龄1877岁。健康体检者51例，男27例，女24例，年龄2382岁。取上述人员静脉血2ml，EDTA-K2抗凝。 1.1.2 试剂美国Becton Dickinson公司HLA-B27 kit: HLA-B27-FITC (Clone GS145.2，IgG1 kappa)；CD3-PE(CloneSK7，IgG1 kappa)；H
4、LA-B27 Calibration Bead；溶血剂(Lysing solution1ys S) 批号为340183，洗涤液及鞘液用Coulter Isoton II血细胞稀释液 批号为 8546733。 1.1.3 仪器美国Beckman CoulterEPICSXL-MCL型流式细胞仪 1.2方法 1.2.1 标本处理取HLA-B27-FITC/CD3-PE荧光抗体30ul、全血样本50ul加入流式专用试管底部，混匀，置于室温避光15min。加10倍稀释后的溶血剂2ml，混匀，避光15min。1500r/min离心5min。弃上清液后用0.01N PBS洗涤两次，上机测定。 1.2.2检
5、测与结果判断流式细胞仪校正使用Beckman Coulter公司的FLOW-CHECK校准光路 样本检测 取标准荧光微球1滴Calibration Bead，用1ml蒸馏水稀释，测到一标准峰。分析已经处理好的样本，选取以CD3-PE标记的淋巴细胞，并检测这群细胞HLA-B27的中间荧光强度(Mdx)，若中间荧光强度大于标准微球峰荧光强度即为阳性，反之则为阴性 2结果 HLA-B27在强直性脊炎患者（AS）和健康体检者中检测结果如下：临床诊断：AS患者例数：56例。阳性例数：51例。阳性率为91.1%，健康体检者 例数：51例。阳性例数：3例。阳性率为5.9% 从上述结果可以看出,AS患者HLA
6、-B27的阳性率高于健康体检者的阳性率。 3讨论 强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种慢性、进行性和炎性疾病，主要累及骶骼关节、脊柱、脊柱软组织及四肢关节，主要症状是腰、骶及下肢关节疼痛，晚期患者脊柱僵硬呈板状，活动受限。HLA-B27与 AS 发病呈高度相关，其相关性为目前已知的HLA与疾病关系中关联性最强和最典型的一种2。有研究表明，HLA-B27检测可提高 X 线诊断AS 的阳性率，对AS早期尤其是X线表现不典型时具有良好的临床应用价值3。 本实验结果提示AS患者HLA-B27阳性率显著高于正常人阳性率，但HLA-B27阳性不能诊断随机选择患者是否患有
7、AS，因为非AS患者也有3%7%的阳性率，但当临床症状体征及影像学检查怀疑有AS时HLA-B27阳性可作为诊断指标。如某患者诊断AS的可能性为50，若患者阳性，则诊断AS的概率提高到95左右；若该患者HLA-B27阴性，则患AS的概率降至3左右。AS患者的临床症状与类风湿性关节炎有相似之处，因此对确诊为类风湿性关节炎的患者要进行B27的检测，以免漏诊。少儿患者因骶髂关节骨后未闭合，也给炎症程度的判断造成困难。所以，AS从发病到明确诊断往往需几年时间。而B27检测可以弥补上述不足，因此B27检测可作为AS的筛选方法。 过去使用的血清学方法存在许多不足：要求用血量大，需无菌分离淋巴细胞，而且分离的
8、淋巴细胞要有足够的活性。所用抗血清为多克隆抗体，特异性较差，实验不易标准化，分析所需时间较长，判断通过记数死亡的淋巴细胞的方法，常含主观人为因素影响。本实验应用流式细胞术，根据直接荧光染色的原理，通过双色直接免疫荧光单克隆抗体试剂抗HLA-B27-FITCCD3-PE与成人外周血淋巴细胞特异性结合，使细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可被流式细胞仪测得，从而判断HLA-B27抗原阳性或阴性，同时可以根据荧光强弱的大小来进行判断HLA-B27的表达情况，具有快速、简单、特异性高的优点。 参考文献： 1李维，府伟灵.流式细胞术检测98例献血者外周血HLA-B27的临床意义J. 第三军医大学学报第,25(8):727-729. 2焦敏,侯卫红.HLA-B27与强直性脊柱炎的相关性研究进展J.中国优生与遗传杂志,2011,19(4):6-8. 3巫翠萍,覃西,赵莲.HLA-B27在诊断早期强直性脊椎炎中的应用价值J.海南医学,2011,22(23):19-21. 编辑/孙杰
