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1、第四章 细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？(1) 按生长方式：2 种类型粘附型(贴壁型)细胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。(2) 根据粘附生长时形态的不同，主要分为4 类：上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞 型、多形型细胞。2、细胞系的生长过程包括哪些主要阶段？每一生长阶段各有什么特征？ 组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells) 所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间，包括原代培养期、传代培 养期及衰退期三个阶段。(1) 原代培养期(Primary Cultu
2、re) 也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4 周。特点：1、细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。2、与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。3、细胞群是异质的，各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强，即细胞独立生存性 差。4、初代培养的细胞多呈二倍体核型。( 2)传代期传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容 器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更 新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改 称做细胞系(Cell Line)。特点
3、：在整个生命期中此期的持续时间最长，整个培养过程的主要时期。细胞增殖旺盛，细 胞生长活跃，并能维持二倍体核型。( 3)衰退期所谓“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。 包括潜伏期、指数增生期、停滞期。( 1)潜伏期细胞对传代操作所致损伤的恢复期和对新的生长环境的适应期，一般为期624h。 也是原代培养开始时细胞必须经历的时期。接种到培养器皿内以后，细胞开始经历黏附、贴壁和铺展等过程。修复损伤，熟悉环境，恢复生长，但很少分裂。接种的细胞密度越大，数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。（2）指数生长期 又叫对数生长期（logarithmic growth phase），是细胞增
4、生最活跃、活力最旺盛的阶 段，培养物中的细胞数量呈指数增长。细胞群体均一，理想的实验用细胞。 细胞分裂活动 （即增殖活性）的衡量指标：有丝分裂扌旨数（mitotic index, MI）细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间 MTT法、标记核苷酸（H3-TdR）掺入法、BrdU标记法注：有丝分裂指数（MI）指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000 个细 胞。一般细胞的MI约为0.10.5%。原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤 细胞高，可达 3%5%。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多，生 长空间渐趋减少
5、，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常 细胞，发生接触抑制。发生接触抑制以后，虽然运动受到限制，但只要营养充分， 细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。 但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养 的枯竭和代谢物的影响，则发生密度依赖性细胞生长抑制，导致细胞分裂停止，细 胞数量即不再增加，进入平台期（停滞期）。（3）停滞期 也叫平台期（plateau phase），意即细胞不再分裂增殖，细胞数量维持在某一水平上, 生长活动停滞。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累， pH 降低。此时需做分离培养即
6、传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则脱落死亡，故 传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下， 虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12 两代，通过换液淘汰死细胞4、体外培养的细胞应满足哪些营养成分？（1）糖（2）氨基酸（3）维生素（4）促生长因子（5）其它物质5、培养液中为何要添加一定量的血清？（血清的主要作用）（1）提供基本营养物质（2）提供激素和各种生长因子（3）提供结合蛋白（4）提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。（5）对培养中的细胞起到某些保护作用：血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这 种作用是偶然发现的，现在则有目
7、的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。6、细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细 胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群， 亦可称之为亚株（Substrain）。7、细胞系：正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。 所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。目前世界上许多 实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下 的宫颈癌细胞培养而成（宫颈癌上皮细胞）。此细胞系一直延用至今。8、原代培养：9、传代培养：
8、当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间 相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物 积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培 养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。 对单层培养而言， 80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。10、克隆培养法：指单细胞培养，使之无性繁殖获得克隆细胞株的方法。有采用在每一毛细 管内滴一滴培养液，各自放入一个细胞进行培养的方法；但一般是在培养皿中使细胞相互间 维持一定的间隔，培养极少量的细胞以使各
9、个细胞得以增殖。11、冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结 晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶， 即冰晶的重结晶。第五章 细胞融合与单克隆抗体1、细胞融合：细胞融合一般是指用人工的方法，即利用电流或各种融合剂如：仙台病毒或 聚乙二醇（PEG ）等，把两个邻接的细胞界膜溶解掉，使二个或二个以上的细胞合并成一个细 胞，最初两个细胞只有胞浆合在一起，核各自独立，这种细胞叫异型核合胞体。经过培养，
10、 通过有丝分裂两种亲细胞的染色体才彼此混合在一起，分到两个子细胞核里去，再经过胞浆 的分裂，变成两个单核杂交细胞。2、单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀 释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的与单一抗原决定簇结合的抗 体。3、杂交瘤：5、HAT选择原理骨髓瘤细胞选择骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B 淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞 融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限 制增殖的特性，又具有免疫 B 细胞合成和分泌特异性抗体
11、的能力。经在HAT培养基含有次黄嘌吟(H)、氨基喋吟(A)和胸腺嘧啶核苷(T)中进行选择性 培养：未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶吟阻断，又因缺乏 次黄嘌吟-鸟嘌吟-磷酸核糖转移酶(HGPRT),不能利用培养基中的次黄嘌吟完成 DNA 的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌吟-鸟嘌吟-磷酸核糖转移酶，因 此能在 HAT 培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培 养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。第六章 胚胎工程1、顶体反应：当获能的精子与卵子相遇时，覆
12、盖于精子顶体表面的细胞膜与顶体外膜融合 并释放出多种酶系，这一过程称为顶体反应。2、发育阻滞：体外受精的早期胚胎在体外发育过程中，往往会停滞在某一阶段不再发育 此现象称之为发育阻滞。3、简述超数排卵的基本方法及其意义？4、同步发情的处理？第七章 干细胞与组织工程1、干细胞：是具有自我更新（Self-renewal）和分化潜能（Potency）的细胞。2、干细胞的分类：按来源分类：胚胎干细胞、成体干细胞。 按分化潜能分类：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞。3、如何调控ES细胞的分化？4、简述ES细胞建系的主要操作步骤？（胚胎干细胞的建系过程）5、如何鉴定ES细胞？（胚胎干细胞的鉴定）（1）细胞
13、形态特征、取材部位（2）细胞表面的特殊标志（3）细胞内干细胞标志基因的表达（4）端粒酶（5）核型分析体内分化（6）分化潜能 体外分化嵌合体：小鼠胚胎干细胞已经制备嵌合体6、追踪了解ES细胞的研究进展，分析讨论其应用前景及其面临的问题?第八章 核移植技术与动物克隆1、“多莉”羊产生的学术意义？2、简述细胞核移植的类型及其主要操作技术？3、核移植技术的应用现状及其发展前景？ 制备转基因克隆动物，进行药物生产 培育优良品种，扩大良种种群 异种克隆，拯救濒危动物 治疗性克隆 培育各种实验动物 基础理论研究 展望：虽然核移植技术有着广阔的应用前景，并且已取得了一些进展如体细胞核移植等，但 也存在着一些问
14、题。主要包括 核移植效率低，动物畸形。这要求研究人员进一步了解核质 作用机理，改进培养方式。4、治疗性克隆：第九章 转基因动物与动物生物反应器1、转基因动物(transgenic animal)：是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色 体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代 的动物。2、简述转基因哺乳动物的制备方法？显微注射法A逆转录病毒载体感染精子载体介导法胚胎干细胞介导法细胞核移植技术 YAC介导的基因转移(1) 显微注射法 操作程序如下：首先，向供体母鼠注射孕马血清，48 小时后再注射人绒毛膜促性腺激素，使其超排卵（排 卵数可达 25 枚
15、）。然后，将此鼠与雄鼠交配获取受精卵，随后将构建的外源基因在体外用显微注射器注射 到受精卵的卵原核中。显微注射完成后，将受精卵移植到假孕母鼠输卵管内，大约 3 周后，代孕母鼠产下 转基因鼠。（2）逆转录病毒载体感染法 原理：利用携带外源基因的逆转录病毒感染胚胎是最早使用的动物转基因方法之一。其基本原理足当逆转 录病毒的 RNA 进入细胞后，逆转录成 DNA （DNA 前病毒），依靠逆转录病毒的整合酶及其末端特异的核苷 酸序列，DNA前病毒可整合到染色体上，从而将其所携带的外源基因插入到染色体上。（3）精子载体法1989 年, Lavitrano 等将质粒与小鼠的附睾精子，在等渗溶液中共育 30 min 后进行体外受精和移植， 产生转基因阳性小鼠并能遗传给后代。Rottman 等对上述精子载体法进行了改进，其将外源 DNA 用脂质体包埋，再与鸡精子共同孵育，然 后人工受精取得成功。Anthony等尝试了一种新的方法，预先将小鼠的精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1 min，然 后将精子头部显微注射入M II期的小鼠卵母细胞，获得成功。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿 过外膜吸附于内膜,更有利于
