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1、由光谱学与电化学渠道(qdo)检测尼古丁对遗传物质DNA的作用(zuyng)Interaction of nicotine with DNA investigated via ultraviolet and electroanalysis methods 化学(huxu)与分子工程学院99级 刘玥 摘 要尼古丁,即烟碱(yn jin)3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶(bdng)在烟草中的重量含量约为1%2%，被公认为是导致吸烟上瘾的主要因子。研究它对DNA的作用以揭示其基因毒性对于阐释尼古丁的致癌致畸机制具有重要的意义。通过对DNA组分与结构的详细分析可知，对DNA复制起到加密作用的是碱基，
2、而具有光学及电化学活性的也恰是A、T、G、C四种碱基，因此可将其作为光与电探测手段的入口点。研究证明紫外谱学的探测手段相对易行且有效，而电化学方法由于DNA的双螺旋结构将活性中心深藏其中从而对电极的设计提出很高的要求。原拟定用碳纳米管修饰的玻碳电极来采集电信号，但实验证明效果并不理想。现在尝试一种新的但颇具潜力的解决方案。即利用甲基纤维素的负温度敏感性将其制成高分子材料电极，DNA分子直接包覆其中。通过参加具备生物兼容性的电解质同时解决降低凝胶点和导电的问题。AbstractConsumption of tobacco is one of the most deadly threaten to
3、 human health. In this sense, it is urgent to investigate whether and how much nicotinecould impose an negative effect on the structure of DNA，therefore causing sufferings particularly from breathing system diseases. A detailed knowledge of the structure of DNA suggests that it is both ultraviolet a
4、nd electrical responsive. The ultraviolet spectrum of the mixture of DNA and nicotine proved the postulation that there do exist an interactionbetween molecules of nicotine and DNA. A certain adduct is probable. Electrodes modified with single wall carbon nanotubes are adopted for eletroanalysis of
5、DNA in solution, yet little responses had been detecteddue to double helix structure of DNA where active centers are deep hidden.Fortunately methylcellulose, a polymer material with thermogelation properties, had been brought into consideration for designing a new electrode where in which molecules
6、of DNA themselves are being trapped.It is a promising new method though highly postulating, and experimentsare being carried out to test its feasibility. 一 引言(ynyn)尼古丁,即烟碱(yn jin)3-(1-甲基-2-吡咯烷基)吡啶(bdng)在烟草中的重量(zhngling)含量约为1%2%。尼古丁不仅(bjn)能转化为具有强致癌性的亚硝胺化合物,而且被公认为是导致吸烟上瘾的主要因子。核酸是遗传信息的载体，它可以与许多化合物发生相互作
7、用如金属离子及其络合物、小分子有机化合物及蛋白质等并进而影响到核酸的复制及断裂；本项研究那么是通过测定尼古丁和DNA之间的相互作用以揭示尼古丁的基因毒性。DNA是由许多单体组成的线形大分子，根本结构重复单元是脱氧核苷酸，其组成结构如下列图所示： 磷酸DNA 脱氧核苷酸 D-2脱氧核糖脱氧核苷 腺嘌呤 碱基 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 (一).DNA的紫外吸收由于嘌呤和嘧啶残基中含有共轭双键结构,所以DNA具有强烈的紫外吸收性质,其最大波长在260nm处.正是由于它有这样的光学活性,故而可以采用谱学探测方法.(二). DNA的电化学1. DNA的电化学活性在DNA的组分中,碱基能发生氧化复原反响.
8、鸟嘌呤和腺嘌呤可以在碳电极上氧化,鸟嘌呤, 腺嘌呤和胞嘧啶也可以在很负的电位下复原,故只能在贡电极上得到复原峰.基于此特性可将电化学的方法作为又一种探测手段。2. DNA在固体电极上的电化学氧化关于DNA电化学性质的研究大多是在贡电极上进行的，但是考虑到贡对于环境的污染 ，在本项研究中采用碳电极，主要针对DNA在碳电极上的氧化行为。已有报导观测到变性DNA在电化学预处理过的玻碳电极上有较显著的电化学行为用循环伏安法可以在0.8伏和1.1伏处得到两个不可逆的氧化峰。但是，要研究尼古丁对人体的基因毒性，自然要用天然的而不是已经变性的DNA。DNA的组分(zfn)中，能发生电化学反响(fnxing)
9、的只是(zhsh)碱基。然而DNA的双螺旋结构(jigu)又将其隐藏在双螺旋内部。DNA变性处理的实质即为其二级结构(jigu)的破坏。原本依靠配对碱基之间氢键作用维系的双螺旋被翻开形成两条单链。从而将包藏于内部的碱基暴露出来，在电极上产生较强的电信号。3. DNA在修饰电极上电活性的改善单层碳纳米管具有很好的电学性质，可以作为一种特殊的电极材料来促进电子的传递。碳纳米管具有独到的优势：极小的尺寸，极高的纵横比，以及具有催化作用的外表。将其修饰在玻碳电极外表是一项很有研究价值的探测手段。 二.实验PART I :紫外局部(一).仪器Cary IE紫外-可见分光光度计Varian公司。(二).试
10、剂小牛胸腺DNA纯度99%，购于sigma；尼古丁中国医药公司，北京采购供给站；石英亚沸三次重蒸水。(三).实验程序1.配置天然DNA溶液.用吸光光度法确定溶液的准确浓度,由于核酸分子的摩尔质量没有确定值，故其精确的浓度应用mg/ml来表达.2.测定尼古丁与DNA作用后的紫外吸收。 配置多种浓度的DNA与Nicotine纯溶液以及多种浓度配比的DNA+Nicotine混合溶液分别测定，用计算机作图并扣除相应浓度的尼古丁溶液的吸收以初步观察尼古丁对DNA的紫外吸收有何影响。3.以相应浓度的尼古丁溶液为空白测定混合溶液的紫外吸收。PART II:电化学局部(一).仪器M273恒电位仪及M270电化
11、学分析系统EG&G, PAR公司，美国；三电极体系：工作电极为玻碳电极，参比电极为饱和甘汞电极SCE,对电极为铂电极；(二).试剂小牛胸腺DNA纯度99%，购于sigma；尼古丁中国医药公司，北京采购供给站；单层碳纳米管SWNT(北京大学化学与分子工程学院制备)；石英亚沸三次重蒸水。(三).实验(shyn)程序1. 玻碳电极(dinj)的修饰 将玻碳电极在金相(jn xin)砂纸上抛光,在麂皮(j p)上用Al2O3粉末抛光至镜面，然后(rnhu)分别用水和乙醇在超声波中清洗，晾干。再用微量注射器取15微升单层碳纳米管悬浮液分三次滴加在玻碳电极外表，至于红外灯下待溶剂挥发。2. 用循环伏安法扫
12、描测定DNA溶液电化学响应 将1mg/ml的DNA储藏液稀释至0.02mg/ml.测定在0.1M磷酸缓冲液中PH7.2 进行。首先，碳纳米管修饰电极在搅拌的DNA溶液中开路状态下富集5min,静至5s，在扫速为100mV/s时从0.2V扫描到1.2V记录循环伏安曲线。3. 用循环伏安法扫描测定DNA与Nicotine混合溶液的电化学响应配置多种浓度配比的DNA+Nicotine混合溶液分别测定，以确定尼古丁对DNA的电化学响应有何影响。三.结果与讨论Part I:紫外局部 1.DNA的浓度测定A(稀释25倍)B(稀释10倍)C(稀释5倍)Wavelength/nm259.00258.00257
13、.00Abs0.69391.76003.1526表1.测定DNA储藏液浓度的三份不同稀释倍数测试液的紫外吸收峰值。当吸光度为1.0时对应的DNA溶液浓度为0.06mg/ml。测得其浓度为1.01 mg/ml。DNA溶液摩尔吸光系数=6600 mol-1.L -1故DNA溶液摩尔浓度约为2.5X10-3mol/L。图1. 测定DNA储藏液浓度的三份不同稀释倍数测试液的紫外吸收图。2.DNA与尼古丁混合溶液的紫外吸收混合溶液的吸收谱图用计算机扣除尼古丁的吸收后，其结果初步证明尼古丁的存在使得DNA在260nm处紫外吸收峰的峰高发生变化。即与DNA分子发生相互作用。更准确的结果可通过实验直接将尼古丁
14、的吸收作为空白扣除。3.以尼古丁为空白的混合溶液的紫外吸收样品123空白nicotine5.0X10-5mol/Lnicotine(1.0X10-4mol/L)nicotine (2.5X10-4mol/L)混合样品DNA5X10-5mol/L +nicotine5.0X10-5mol/LDNA5X10-5mol/L+nicotine(1.0X10-4mol/L)DNA5X10-5mol/L+ nicotine(2.5X10-4mol/L)表2.各混合(hnh)液体中DNA与Nicotine的浓度(nngd)比及其相应空白尼古丁溶液的浓度图2.纯尼古丁溶液(rngy)A与各混合(hnh)溶液(B.C.D.)的紫外吸收(xshu)图.样品峰高与纯DNA吸收值之差A0.329B(1:1)0.3390.0103%C(1:2)0.3630.0247%D(1:5)0.4180.05513%表3. 将各混合溶液在260nm处的紫外吸收与纯DNA溶液在该波长的吸收值之差图3.尼古丁存在(cnzi)时引起DNA紫外吸收(xshu)的改变对尼古丁浓度的线性拟和Part II:电化学局部(jb) 循环伏安法扫描(somio)未得到预
