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1、微量凯氏定氮法测定蛋白质含量实验报告一、实验目的1. 学习微量凯氏定氮法的原理2. 掌握微量凯氏定氮法的操作技术（未知样品的消化、蒸馏、滴 定及其含氮量的计算等）二、实验原理凯氏定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等） 的含氮量。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被氧化成二氧 化碳和水，而氮则变成氨并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程称 为“消化”。此过程进行的相对较为缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提 高溶液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。氧化 剂过氧化氢也能加速反应。消化过程：2NH3 + H2SOr （NH4）2SO含氮有机物 + H2SO r
2、 CO + SO + H O + NH3蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气。反应方程式如下：（NH ） SO + 2NaOH t Na SO + 2NH OH4 24244吸收与滴定：蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止（即滴定至蓝紫色），最后根据所用标准酸的当量数（相当于待测 物中氨的当量数）计算出待测物中的氮量。NH3 + H3BO t NH4H BONH4H BO + HCL J NH4CL + H3 BO三、实验试剂、材料和器材实验材料：食用面粉。实验试剂：浓硫酸、30%氢氧
3、化钠溶液、克氏催化剂、2%硼酸、指示剂、0.01M HCL。实验器材：凯氏烧瓶、电炉、凯氏定氮蒸馏装置、锥形瓶、100ml容量瓶、酸式滴定管。四、操作步骤1. 消化（1）准确称取1克食用面粉，用称量纸卷好小心送入至50毫升的凯氏烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上；（2）向另一烧瓶加入血1水作空白对照；在每个烧瓶内加入硫酸钾一硫酸铜混合物（克氏催化剂）少许， 浓硫酸10ml，小瓷片两粒，摇匀；（3）将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在 通风厨内的电炉上消化；（4）在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈；（5）待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当 加强火力，继续消
4、化，直至消化液呈透明绿色为止；（6）消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml（注意慢 加，边加边摇）；（7）冷却后将瓶中内容物转入100ml的容量瓶中，并用蒸馏水 洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号 备用。2. 蒸馅（1）蒸馏器洗净后，开放水龙头P3,使水进入A室，水放至A 室球部2/3处即可。（2）取3个50ml的锥形瓶，分别加入10ml硼酸（内加有混合 指示剂）。用表面皿复盖备用。（3）加样 用移液管吸取2ml消化液，小心地由漏斗。倾入8室； 取一个盛有硼酸的锥形瓶，置于M管下，使管口恰好接触 硼酸溶液，用量筒从漏斗。加入30%氢氧化钠5ml,随即将P4夹紧
5、， 并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。（4）蒸馏 用酒精灯加热，维持火力恒定，沸腾不可高于Y管口以免 A室溶液从Y管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起，继 续蒸馏5分钟； 然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，最后用 蒸馏水洗导管外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶准备滴定。（5）空白蒸馏用移液管分别吸取2ml蒸馏水按上述操作步骤进行蒸馏。仪器的洗涤：3. 滴定（1）蒸馏完毕，用微量酸式滴定管，以0.01mol/L盐酸标准溶液进行滴定锥瓶内溶液，溶液由蓝绿色变为淡紫色或灰色，即为终点。（2）记录所用盐酸的量。4. 计算L、,，. 口 jlaa f. / -*n /、（A B）X 0.0100 X
6、 14 icc样品的总氮含量（克氮）=X 100CX1000若测定的样品含氮量部分只是蛋白质则：样品的总蛋白含量（克蛋白） = B）X0.0100X14X6.25 X 100Cx1000式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数:0.0100为盐酸的当量浓度（实际上，此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14毫克氮）。五、实验结果序号称量样品（g）滴定样品用去的盐酸（ml）滴定空白用去的盐酸（ml）1115.20.122115.4滴定样品用去盐酸平均值=15.2 +15.42=15
7、.3（ ml）m 口 A/ t4 行/冬.曰，士（A B）x0.0200x 14样品的总氮含量（克氮） =X100Cx1000=0.43%若测定的样品含氮量部分只是蛋白质，则：样品的总蛋白含量（克蛋白）=篁M0竺冬25，100、CX1000=2.66%式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C为称量样品的克数:0.0100为盐酸的当量浓度（实际上， 此项应按实验中使用盐酸的实际浓度填写）；14为氮的原子量；6.25为常数（1毫升0.1N盐酸相当于0.14 毫克氮）。六、注意事项1. 本法适用于0.05-3.0mg氮，样品中含氮量过高时，则应减少 取样量或将样液
8、稀释。2. 勿使样品粘于烧瓶颈部。放置液体样品时，需将吸管插至烧瓶 底部再放样：如固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然 后再将烧瓶直起，纸卷内的样品即完全放在烧瓶底部。3. 蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着 在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后移开酒精 灯，绝不能先灭灯，否则吸收液将发生倒吸。4. 硼酸吸收液的温度不应超过40C，否则氨吸收减弱，造成损 失，可置于冷水浴中。混合指示剂在碱性溶液中呈兰绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸 性溶液中呈红色。七、思考题1. 写出一下各步的化学反应方程式:蛋白质的消化、氨的蒸馏、氨的 滴定。答：蛋白质的消化：
9、含氮有机物 + H25% t CO? + Sq + H O + NH3氨的蒸馏：（NH ） SO + 2NaOH t Na SO + 2NH OH4 24244NH OH t H O + NH 个NH 3 + H 3 BO 3 t NH 4 H 2 BO 3氨的滴定：NH 4 H 2 BO 3 + HCL t NH 4 CL + H 3 BO 32. 指出本测定方法产生误差的原因答：在消化过程中，消化时间，催化剂，浓硫酸都要一样，一 定要消化完全。在消化过程中蛋白质附着在凯氏烧瓶壁上没有被消化 也会影响最终的浓度。 蒸馏过程中，蒸馏出来的液体量一定要相同，因为不一样的蒸 馏水，最后结果不一样，
10、在蒸馏的过程中一开始要加入买的蒸馏水， 蒸馏过程中加入的是自己用自来水蒸馏的。蒸馏中出气孔的管子一定 要插入硼酸液面以下，蒸馏过程中保证冷凝水一直在流动。蒸馏过程 中定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。加入消 化液后加氢氧化钠应小心缓慢加入，开关甲不能常开，加完后加水液 封。 滴定过程中应一滴一滴加入，滴定速度过快容易滴定过量。滴 定过程中仰视刻度结果偏小，俯视刻度线结果偏大。 蒸馏装置的洗涤过程中洗涤不干净也会导致误差的出现。 本实验方法适合测量0.05-3.0mg氮，含量过大应该减少取样 量或者样液稀释。否则会产生误差。3. 消化过程中产生何种有毒气体？如何判断消化终点？答
11、：可能会产生一氧化氮、二氧化氮、二氧化硫。消化终点判定：在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶 颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火 力，继续消化，直至消化液呈透明绿色为止。八、讨论经过本次利用微量凯氏定氮法进行面粉中蛋白质的粗测定实验， 使我较为熟练的掌握了凯氏定氮蒸馏装置的使用，并且了解了其工作 原理，这对于以后的学习是有很大帮助的。经查阅资料得，面粉中蛋 白质的含量大概在9%左右，本次实验的结果为2.66%，总体来讲， 本次试验较为失败，没能够粗略地测量出了面粉中蛋白质的含量。经 过分析后，得出几点影响实验结果的因素，如下：1. 在消化过程中，消化时间，催化
12、剂，浓硫酸都要一样，一定要 消化完全。在消化过程中蛋白质附着在凯氏烧瓶壁上没有被消化也会 影响最终的浓度；2. 蒸馏过程中，蒸馏出来的液体量一定要相同，因为不一样的蒸 馏水，最后结果不一样，在蒸馏的过程中一开始要加入买的蒸馏水， 蒸馏过程中加入的是自己用自来水蒸馏的。蒸馏中出气孔的管子一定 要插入硼酸液面以下，蒸馏过程中保证冷凝水一直在流动。蒸馏过程 中定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。加入消 化液后加氢氧化钠应小心缓慢加入，开关甲不能常开，加完后加水液 封；3. 滴定过程中应一滴一滴加入，滴定速度过快容易滴定过量。滴 定过程中仰视刻度结果偏小，俯视刻度线结果偏大；4. 蒸馏装置的洗涤过程中洗涤不干净也会导致误差的出现；5. 本实验方法适合测量0.05-3.0mg氮，含量过大应该减少取样 量或者样液稀释。否则会产生误差；6. 用量筒量取溶液时，仰视或俯视读数，会导致量取液体出现误 差；7. 实验操作不能做到完全规范，例如润洗移液管等，同样会导致 误差；8. 滴定时，操作不够规范，可能会有些许误差。综上所述，本次实验的误差主要是由于仪器误差以及操作不当导 致，因此在以后的学习实验过程中，会更加着重注意实验前对实验器 材完好程度的检查以及实验操作的规范性，严格要求自己，努力做到 更好！
