串联质谱技术的应用综述

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1、有机结构分析II串联质谱技术的应用液相色谱-质谱法(LC/MS)将应用范围极广的分离方法与灵敏、专属、能提供 相对分子质量和结构信息的质谱法结合起来，因此已成为一种重要的现代分离分析 技术。虽然与LC相连的单极质谱仪也能够提供相对分子质量的信息，但不足之处 在于基质对待测组分的干扰难以排除及待测组分的结构信息不能充分利用。液相色 谱与串联质谱联用可在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰， 几乎不产生碎片离子，并可对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的化合物碎 片信息，可用来推断化合物结构，确认目标化合物，辨认重叠色谱峰以及在高背景 或干扰物存在的情况下对目标化合物定量，因而成为

2、药物代谢过程和产物研究，复 杂组分中某一组分的鉴定和定量测定，以及药用植物成分研究中更为强有力的工 具。本文对液相色谱-串联质谱法(LC-MSn)的原理及其在药物代谢方面的应用作简 要介绍。1串联质谱(MS/MS)基本原理1.1离子源离子源的种类包括：电子轰击电离(EI)、化学 电离(CI)、快原子轰击 (FAB)、场电离(FI)和场解吸(FD)、大气压电离源(API)、基质辅助激光解吸离子化 (MALDI)和电感耦合等离子体离子化(ICP )等。现在主要采用大气压离子化技术 (API),包括电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)和大气压光电离化 (APPI)。API是软电离技术

3、，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物。其 中,ESI应用十分广泛，适用于极性、热不稳定、难气化的成分分离分析，小到无 机离子，大到蛋白质、核酸ESI-MS中可以容易地控制碎片的裂解程度。用串联 质谱可以选择特定的离子，通过碰撞诱导解离(CID)使其碎裂成碎片离子;另一种方 法是通过改变锥孔(取样口)电压(源内CID)的方式，无选择地将源内所有的离子击 碎。1.2质量分析器及其特点质量分析器是质谱计的核心，不同类型的质量计其功能、应用范围、原理和 实验方法均有所不同。磁质谱:分为单聚焦磁场分析器和双聚焦分析器。离子源中 生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。离子离开离子源后，进入垂

4、直于 其前进方向的磁场。不同质荷比的离子在磁场的作用下，前进方向产生不同的偏转, 从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径, 通过改变磁场强度，检测依次通过狭缝出口的离子，从而实现离子的空间分离，形 成质谱。高分辨的双聚焦质谱仪可以测定分子离子的精确质量数(误差在5 ppm以 下)，可以确定元素组成。四极杆分析器(简写为Q):因其由四根平行的棒状电极组成而得名。离子束在 与棒状电极平行的轴上聚焦，一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用在棒 状电极上，两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压，特定质荷比的 离子在轴向稳定运动，其他质荷比的离子则

5、与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的 斜率变化，可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。离子阱分析器(TRAP):由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极 构成。端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加射频电压(RF)，通过施加适当电 压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小，离子阱就可捕获某一质 量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累积到一定数量后，升高环电极上的 RF电压，离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱，被电子倍增监测器检测。 离子阱分析器现已可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度，而且单个离子阱通过时间

6、序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的 功能。飞行时间分析器(TOF):具有相同动能，不同质量的离子，因其飞行速度不同 而分离。如果固定离子飞行距离，则不同质量离子的飞行时间不同，质量小的离子 飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离 子以离散包的形式引入质谱仪，这样可以统一飞行的起点，依次测量飞行时间。离 子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生，但只在某一特定的时间引入飞行管。 TOF具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率，尤其适合蛋白等生物大分子分 析，常用MALDI为离子源。其分辨率随着质荷比的增大而降低。傅里叶变换-离子回旋共振分析器(FT-ICRM

7、S):在一定强度磁场中，离子做圆 周运动，离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时， 离子稳定加速，运动轨道半径越来越大，动能也越来越大。当电场消失时，沿轨道 飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间 与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。优点为分辨率很高，质荷比 可以精确到千分之一道尔顿，但价格十分昂贵。液相色谱与串联质谱联用的质量分 析器中最常用的是四极杆分析器，其次是离子阱分析器和飞行时间分析器。1.3串联质谱的方式两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。串联质谱根据连接方式的不 同一般分为空间串联和时间串联。空间串联型又

8、分磁扇型串联，四极杆串联，混合 串联等。如果用B表示扇形磁场，E表示扇形电场，那么串联质谱主要方式有:空 间串联(如磁扇型串联方式:BEB, EBE, BEBE等；四极杆串联:Q-Q-Q;混合型串 联:BE-Q、Q-TOF和EBE-TOF等)时间串联:离子阱质谱仪和回旋共振质谱仪。另 外，还有Q-TRAP等。1.4串联质谱的工作无论是哪种方式的串联，都必须有碰撞活化室，从第一级MS分离出来的特定 离子，经过碰撞活化(碰撞气常用N2和Ar等)后，再经过第二级MS进行质量分析， 以便取得更多的信息。最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱(QQQ)。第一级和 第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2,第

9、二级四极杆分析器所起作用是将从MS1 得到的各个峰进行轰击，实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。1.5串联质谱数据采集方式串联质谱主要有4种数据采集方式: 子离子扫描:选择一定的母离子经CID 活化，MS2记录产生的子离子。该方式特别适合于软电离(如ESI,CI, FD, FAB)得 到的分子离子进一步裂解以获得分子的结构信息。通常先收集母体药物的子离子谱, 再获得代谢物的子离子谱，根据生物转化/代谢的位点，可以提供丰富的结构信 息。合理化裂解的这些碎片离子通常可提示药物代谢物的可能结构。母离子扫 描:选择MS2中的某一子离子，测定MS1中的所有母离子。该方式能帮助追溯碎片 离子的来源，能对产

10、生某种特征碎片离子的一类化合物进行快速筛选。这种扫描功 能在药物代谢中非常重要。中性丢失扫描:MS1和MS2同时扫描，但MS2与MS1 始终保持质量差(即中性丢失质量)Am,最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过 裂解丢失中性碎片(Am)的离子。中性丢失谱最能反映化台物的特定官能团，如有中 性丢失18Da的意味着-H2O。中性丢失扫描广泛地用于测定II相代谢过程变化，如 葡萄糖醛酸苷(-176Da)和硫酸盐(-80Da),同样可以测定谷胱苷肽(GSH)加合物(- 129Da)。 多反应检测(MRM)或选择反应监测(SRM):由MS1选择一个或几个特定离 子，经碰撞碎裂之后，由其子离子中选出一特

11、定离子，只有同时满足MS1和MS2选 定的一对离子时，才有信号产生。用这种扫描方式的好处是增加了选择性，即使2 个质量相同的离子同时通过了 MS1,但仍可以依靠其子离子的不同将其分开。这种 方式非常适合于从很多复杂的体系中选择某特定质量，经常用于微小成分的定量分 析。空间串联质谱的3种方式为子离子扫描、母离子扫描和中性丢失扫描，而时间 串联质谱只能完成子离子扫描。目前，这4种扫描方式已越来越广泛地应用在药 物代谢研究方面。2串联质谱法在药物代谢中的应用药物代谢涉及药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄的研究。包括药物及 其在各种复杂基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定

12、以及痕量分析测定。2.1药物及其代谢物的痕量分析测定药物代谢动力学参数以研究药物的生物利用度和生物等效性为主，常用 QQQ,因其具有较高的选择性、信噪比。生物样品中有大量的保留时间相同、相对 分子质量也相同的干扰组分存在。为了消除其干扰，定量的最好办法是采用串联质 谱的多反应监测(MRM)技术。分析样品时，第一级质谱选定m1 ,经第二级碰撞活 化后，第三级质谱选定m2。只有同时具有m1和m2特征质量的离子才被记录。 这样得到的色谱图就进行了 3次选择:LC选择了组分的保留时间，第一级MS选择 了 m1 ,第三级MS选择了山2 ,这样得到的色谱峰可以认为被干扰的几率极小。然 后，根据色谱峰面积，

13、采用内标法进行定量分析。这是目前应用最多的一种测定方 法，如Suryawanshi等1利用MRM技术测定大鼠血浆中芒果苷和4种环烯醚萜苷 的药动学参数;沈凯等2利用MRM技术定量测定人血浆中替比夫定的浓度;徐珊珊 等3利用MRM技术同时测定人血浆中西替利嗪和伪麻黄碱的浓度，均取得较好的 测定结果。2.2 药物代谢物的结构鉴定由于多数药物的代谢物保留了母体药物分子的骨架结构或一些亚结构，因此， 代谢物可能进行与母体药物相似的裂解，丢失一些相同的中性碎片或形成一些相同 的特征离子，用串联质谱分别进行中性丢失扫描、母离子扫描和子离子扫描，即可 迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。Yost等4总结了和

14、用串联质谱鉴定药 物代谢物的方法，主要包括以下几个步骤:测定母体药物的质谱。测定母体 药物的子离子谱，选择质子化分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行裂解。 选择母体药物的主要中性丢失测定生物样品的中性丢失谱， 图谱中的离子即为母体 药物和可能的代谢物的分子离子。选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱, 所得母离子即为各个代谢物。测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解 谱得到代谢物的结构。测定代谢物的子离子谱.选择任一新出现的中性丢失和子 离子重复进行步骤，。2.2.1 QQQ在药物代谢产物鉴定中的应用药物代谢的研究中，由于母体药物结构已知，药物代谢途径常常可以预期， 根据体内I相和II相

15、代谢的一般规律（见表1和表2）,张喆等5用高效液相-电 喷雾串联四极杆质谱法首次考察了毛果芸香碱在大鼠尿中的代谢情况，采用MRM方 法推测了毛果芸香碱在大鼠体内的5种代谢产物。表1 I相代谢过程的质量偏移6过程基团生物转化奶住基化F 16芳映AEH- AnjH脂肪展R 电 H R-lHiJH环瓠化质化更化R SR- R-S)R近垸基14N院基kSH-lH, RM耳（哽姑JtOlHj WJH阪垦R-31腊氧化酶-3()怕基KN广 R-Nl脱且酶_ 2乙蜉r HK耳 XHr SMtn!W mni! Acid一碰环独化物Aq (Jb-SCr-1整环遇化物 AiXJ Al ai)-S-MeruiPiiiicAcH+淀貌基成WR+7.1河巍酸一网-m-143答氨酰胺