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1、院级本科生科技创新基金项目研究报告项 目名称 畜、禽肉中八种抗生素的测定立项时间2011年3月计划完成时间2012年3月项目负责人邓明镜学院与班级化生学院生技0901班2012年 4 月 22 日北京科技大学 教务处摘要抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其 它活性的一类次级代谢产物，主要用于治疗各种细菌感染或其以致病微生物感 染，广泛应用于医药卫生领域中。有人估计，由于抗生素的发明，全人类的平均 寿命增加了 10 岁。但是，抗生素的广泛使用，也带来了一些严重问题。例如， 若过量的注射或在饲料中添加抗生素，将致使病菌耐药能力逐年增强，从而减少 畜、禽对病菌的抵抗力；而
2、人体经常摄入低剂量的抗生素残留物，会逐渐在体内 蓄积而导致各种器官病变。所以抗生素残留已经成为乳肉类食品安全中一个日益 严峻的问题。本实验采用高效液相色谱法（HPLC）,在中华人民共和国国家标准方法（ GB/T 5009.116-2003 ）的基础上进行优化，旨在建立一种能够同时检测畜禽肉 中土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、四环素（TC）、氯霉素（CLP）、磺胺、磺胺 二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲恶唑（SMZ）和氟哌酸（FPA）八种抗生素的方法。 实验时色谱条件为：色谱柱规格ODS-C8（5p m）6.2mmX 15cm,检测波长355nm 和280nm,柱温40C,流速0.8mL/min,
3、进样量20L,流动相为乙腈：0.01mol/L 磷酸二氢钠（用 30%硝酸溶液调节 PH2.5） =23:77。本方法对八种抗生素的分离效果较好,实现了基线分离。实验中分别研究并 确定了八种抗生素的检出限（LOD）、定量限（LOQ）和线性范围；而在实际肉 样的测定中,由于磺胺的出峰时间与鸡肉杂质峰相重合,所以我们比较三种 C18 固相萃取小柱对干扰物的去除效果,实验结果表明杂质的去除效果均不明显,无 法测算其标准曲线,而其他七种抗生素测定效果理想。本方法的建立更快捷的实 现了肉类中多种抗生素残留的检测；不仅节约了实验室检测的成本,缩短了检测 时间,还大大提高了检测精度。关键词 抗生素 高效液相
4、色谱 畜禽肉目录摘 要11 绪论 31.1 项目背景条件 31.2 项目意义 31.3 主要工作 32 文献综述42.1 抗生素概述错误！未定义书签。42.1.1 抗生素定义42.1.2 抗生素种类42.1.3 四类抗生素简介52.2 抗生素残留现状52.3 抗生素残留检测方法62.4 高效液相色谱法72.4.1 高效液相色谱法原理72.4.2 高效液相色谱法特点72.4.3 ODS 柱和固相萃取小柱72.5检出限（LOD）和定量限（LOQ） 83 畜禽肉中八种抗生素的检测93.1 实验材料及仪器93.1.1 材料93.1.2仪器93.2 实验方法93.2.1 猪肉中土霉素、四环素、金霉素残留
5、量的测定93.2.2猪肉中氯霉素残留量的测定103.2.3条件优化，鸡肉中四环素残留的测定113.2.4八种抗生素检出限（LOD）,定量限（LOQ）和线性范围的确定113.2.5 鸡肉中八种抗生素含量的测定113.2.6 固相萃取小柱的净化124 实验结果与讨论124.1 猪肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定124.2 猪肉中氯霉素残留量的测定154.3 条件优化，鸡肉中四环素残留的测定174.4八种抗生素检出限（LOD）,定量限（LOQ）和线性范围的确定194.5 鸡肉中八种抗生素含量的测定194.6 固相萃取小柱的净化24结 论25参 考 文 献28附 录 A 原始数据致 谢1 绪论1
6、.1 项目背景条件抗生素最早发现于 1929年，英国科学家弗莱明培养细菌时观察到，空气中 偶然落在培养基上的青霉菌的菌落周围没有其他细菌生长，他认为是青霉菌产生 了某种化学物质，并且分泌到培养基中抑制了细菌的生长。这种化学物质就是最 早发现的抗生素(antibiotics)青霉素。青霉素作为治疗细菌感染的特效药，在 第二次世界大战中挽救了无数人的生命。自 20 世纪初青霉素问世以来，抗生素作为抗感染治疗的重要药物，在保障 人类健康中发挥着重要的作用。随着现代医药科学技术的进步，在畜、禽、牧、 水生生物等产业领域应用药物对动物进行诊断、预防和治疗疾病，以及促进动物 生长、提高饲料转化率等日益普遍
7、，并且带来了可观的经济效益。但人们长期食 用这种动物食品及制品，必然会危及人类健康。一些国家相继成立了各种相应的 管理组织，通过立法来规范、制定和管理动物组织及产品中抗生素残留的限量标 准，我国还加强了对动物性食品中抗生素残留的检测、检查工作以及对各种违法 犯罪行为的打击力度。1.2 项目意义研究表明，动物源食品中残留抗生素是诱发儿童肥胖的一个重要因素，长期 食用有抗生素残留的动物性食品，不仅会使病菌产生抗药性，而且还会造成一些 非致病菌的死亡。例如人体肠道内寄生着对人体有益的微生物菌群，它们与人体 为互利共生关系，正常情况下，微生物菌群处于平衡状态；若体内抗生素积蓄过 量，将导致菌群失调，同
8、时肠道内产生维生素B族和维生素K族的细菌受到抑制， 造成严重的肝损害，从而引起维生素缺乏。经常食用含有青霉素、四环素、磺胺 类药物的乳肉制品，极易引起易染个体的过敏反应，严重者可引起皮疹、呼吸困 难、休克等症状，甚至危及生命。乳肉类中抗生素的检测根据检测原理不同，主要分为免疫学方法、微生物法 和理化分析法三类。但是在动物源性食品中，由于其蛋白质及脂肪含量高、基质 复杂等原因，对磺胺及四环素类抗生素残留的测定多采用分别测定的方法，较费 时费力。而最有效的检测方法是采用固相萃取净化、色谱分离后进行质谱分析， 该法需昂贵的仪器，在推广上受到限制。所以，建立一种简便、快捷、灵敏且同 时可以检测多种抗生
9、素的检测方法迫在眉睫。本方法建立了同时测定动物源性食品中常用的 3 种磺胺类药物：磺胺二甲 嘧啶、磺胺甲恶唑和磺胺； 3 种四环素类药物：土霉素、四环素和金霉素； 一种喹诺酮类药物：氟哌酸；和一种氯霉素类药物：氯霉素，共八种抗 生 素残留的方法，根据用高效液相色谱法(HPLC )测定畜禽肉中土霉素、四 环素和金霉素的中华人民共和国国家标准，改良优化其方法步骤，以节约 实验室检测的费用及检测的时间，避免重复性劳动，达到快速、便捷的效 果。1.3 主要工作本实验检测的动物性食品为畜、禽肉，主要仪器是高效液相色谱仪，在中华 人民共和国国家标准方法(GB/T 5009.116-2003)的基础上进行优
10、化，具体工作如下： 测定八种抗生素的出峰时间、线性范围、检出限和定量限； 测定猪肉中土霉素、四环素、金霉素、氯霉素残留量； 优化实验条件，测定鸡肉中四环素残留量； 测定鸡肉中八种抗生素含量； 比较三种 C18 固相萃取小柱对干扰物的去除效果。2 文献综述2.1 抗生素概述2.1.1 抗生素定义抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其 它活性的一类次级代谢产物，且能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。在体 外能抑制微生物的生长，而对宿主不会产生严重的副作用。通俗地讲，抗 生素就是用于治疗各种细菌感染或其以致病微生物感染的药物。抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌
11、而且对霉菌、支 原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，近年来通常 将抗菌素改称为抗生素。卫生部调查显示，我国是世界上抗生素滥用最严重的国家，平均每年每人要 “挂8 瓶水”，远远高于国际上 2.5 瓶-3.3 瓶的水平。据不完全统计，我国抗生素 人均年消费量为 138 克左右，是美国的 10 倍。在中国住院患者中，抗生素的使 用率达到 70%，而实际上八成病人不需要抗生素。除经济利益外，抗生素滥用 还来自于病人的压力以及医生的用药习惯。2.1.2 抗生素分类抗生素主要有以下几种分类： P -内酰胺类青霉素类和头抱菌素类分子结构中含有P -内酰胺环为基本特征。近年来又发现了硫酶素类
12、、单内酰环类，P -内酰酶抑制剂、 甲氧青霉素类等几类抗生素。 氨基糖甙类包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。 四环素类包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。 氯霉素类包括氯霉素、甲砜霉素等。 大环内脂类临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。 作用于G+细菌的其它抗生素如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。 作用于 G 菌的其它抗生素如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。 抗真菌抗生素如灰黄霉素。 抗肿瘤抗生素如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。 具有免疫抑制作用的抗生素
13、如环孢霉素。2.1.3 八种抗生素简介本实验检测的八种抗生素主要为四大类：四环素类的土霉素、四环素、 金霉素；氯霉素类的氯霉素；磺胺类的磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺； 喹诺酮类的氟哌酸。四环素类：四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，其结构 均含并四苯基本骨架。广泛用于多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体 等所致之感染。四环素类抗生素在酸性和碱性条件下均不稳定，四环素类 药物中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能与多种金属离子 形成不溶性螯合物。与钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐，与铁离子形 成红色络合物，与铝离子形成黄色络合物。氯霉素类：一种由委内瑞拉链霉菌中分离提取的广谱
14、抗生素。对许多 需氧革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、厌氧的拟杆菌、立克次氏体、衣 原体及菌质体都有抑制作用，尤其对沙门氏菌属、流感杆菌和拟杆菌属等 有良好的抗菌能力。氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇与二氯乙 酰胺三个部分，其抗菌活性主要与丙二醇有关。磺胺类：为人工合成的抗菌药，具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简 便、生产时不耗用粮食等优点。磺胺类药物一般为白色或微黄色结晶性粉 末，遇光易变质，色渐变深，大多数本类药物在水中溶解度极低，较易溶 于稀碱，但形成钠盐后则易溶于水，其水溶液呈强碱性。尽管目前有效的 抗生素很多，但磺胺类药在控制各种细菌性感染的疾病中，特别是在处理 急性泌尿系统感染中
15、仍有其重要价值。磺胺类药易产生耐药性，在肝内的 代谢产物一-酰化磺胺的溶解度低，易在尿中析出结晶，引起肾的毒性， 因此用药时应该严格掌握剂量、时间，同服碳酸氢钠并多饮水。临床常用 的磺胺类药物都是以对位氨基苯磺酰胺（简称磺胺）为基本结构的衍生物。 对许多革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌、诺卡氏菌属、衣原体属和某些 原虫（如疟原虫和阿米巴原虫）均有抑制作用。喹诺酮类：又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类合成抗菌药。喹诺酮 类以细菌的脱氧核糖核酸（DNA）为靶。妨碍DNA回旋酶，进一步造成细 菌 DNA 的不可逆损害，达到抗菌效果。本类药物与许多抗菌药物间无交叉 耐药性，是理想的抗菌药。喹诺酮类是主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物， 对革兰阳性菌的作用较弱（某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作 用）。2.2 抗生素残留现状近 60 年来，抗生素是用于治疗人类及兽类疾病的最常用药物。抗生素在人 类的防病、治病，和畜牧业中都发挥着巨大的作用。但随着人类生活水平的提高， 抗生素残留已经成为了乳肉类食品安全的一个重要问题。抗生素残留是指给动物使用抗生素药物后积蓄或储存在动物细胞、组织或器 官内的药物原形、代谢产物或药物杂质。现在这个问题日趋严
