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1、从环境样品中分离筛选石油降解菌的方案引言随着经济技术的迅速发展， 石油日渐成为我过的主要能源， 且需求量 日益增大。 研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染， 且污 染面积不断扩大。目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。 由于石油的 粘度大、粘滞性强， 会再短时间内形成小范围的高浓度污染， 长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。 同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起 人体麻醉、 窒息和化学性肺炎等疾病。 因此，石油污染对土壤生态系统的 平衡和人体健康都有很大的危害。目前，针对石油污染治理的方法主要包括： 物理方法、 化
2、学方法以及 生物修复法， 但物理方法修复费用较高， 耗材较多： 化学方法会使用大量 化学淋洗剂， 很容易造成二次污染。 相较而言， 微生物修复技术由于生产 费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技 术。而且随着分子生物学的发展，无论是 DNA 文库的建立，还是多态性 分析方法的进步， 都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。 既然生 物修复法有诸多优点， 那么就应该充分发挥其特性。 本文则是着眼于环境 样品，分离筛选其中的石油降解菌， 以扩大培养进行更大规模的石油降解。摘要在长期被石油污染的土壤中， 微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适 应环境。即以石油烃为碳源进行生长、
3、繁殖，同时将石油烃降解。因此在 这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物， 但石油烃降解菌的筛选、 分离 是生物法处理石油污染的关键。 从这个角度考虑， 以长期石油污染的土壤 中微生物为菌源， 从中筛选、 分离出高效的石油烃降解菌。 要降解哪里的 石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。 目前，国内对极端条件下石油降解 微生物研究较少， 尤其是对低温、 耐盐的石油降解菌， 中国北方的大部分 湿地， 盐碱程度比较高， 成年气温较低。 无论是来源于海上还是来源于石 油化工的污染都比较严重。 本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白 石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。一、技术路线生物修复是指
4、利用生物的代谢活动催化降解偶记污染物，从而去除或 消除环境污染的一个受控或自动进行的过程。它利用处理系统中的生物， 主要是微生物的代谢活动来减少污染现场污染物的浓度或使其他无害化 的过程污染物的生物修复作用， 本质上是开发利用微生物的新陈代谢能力 以及基因的多样性， 把污染物转化为无污染的中产物， 重新进入生物地球 化学循环。1、菌种的初筛将一定量的样品置于锥形瓶中加入生理盐水稀释适宜倍数后分别在PDA培 养基以及牛肉膏蛋白胨培养基上进行涂布, 待表层液体被培养基吸收后, 倒置, 放 于30C恒温培养箱中培养。2、菌种的富集将平板上长势良好的 20 株菌接种到盛有十六烷富集培养基的锥形瓶 中，
5、加以标记，分别命名为 LZX21LZX210 （蛋白胨培养基）和LZZ21 LZZ210（ PDA培养基）。30C下恒温振荡培养。3、菌种的驯化菌种的驯化过程采用原油液体培养基中原油浓度逐渐升高的方法， 取上述 富集培养中长势较好的 14 株菌, 依次接种至不同质量浓度的原油液体培 养基中，于30C下恒温振荡培养，以3天为一个周期，进行4个周期的驯 化。驯化后进行标号。后将其分别编号为0DZ2ODZ27,ODX2ODX274、菌种的复筛优势降解菌种的复筛采用观察石油降解圈的方法。 将菌种点接到一定质 量浓度的原油平板培养基中 , 放置到恒温箱中培养。 培养一段时间后 , 根椐 每个菌落产生的石
6、油降解圈的大小 , 挑选优良菌种二、样品采集取大连开发区白石湾的海水样品进行分离和筛选三、培养基成分人工海水培养基（ MMC ）： Nacl 24g/L; MgSO4 ?7H2O7g/L;NH 4NO3 1g/L;KCl0.7g/L;KH 2PO4 20g/L;Na2HPO4 3.0g/L; PH7.4. 灭菌后补加适量微量元素混合液， 并补以柴油作为唯一碳源。 柴油及微 量元素经0.22卩m滤膜过滤除菌。高盐LB培养基（HLB） : Nacl30 g/L;胰蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L; PH7.0.微 量 元 素 混 合 液 :CaCl0.02mg/L;FeCl56H2O0.5mg
7、/L;CuSO40.005mg/L;MnCI 2 4H200.005mg/L;ZnS04 7H2OO.I mg/L四、培养条件1、 温度：石油烃类微生物降解可在很大的温度范围内发生，在070C 的环境中均发现有降解石油烃类的微生物。 大多数微生物在常温下较容易 降解石油烃类，且由于某些对微生物有毒害的低分子量石油烃类在低温下 难挥发，会对石油烃类的降解有一定的抑制作用， 所以低温下石油烃类较 难降解。将降解培养基的初始pH调整到7. 5, 4株菌接种到50ml含油（原 油质量浓度为500mg/L）无机盐培养基中，分别在25C、30C、35C、40C、 50C的恒温摇床上进行振荡培养，培养7 d
8、后,测定原油的降解率，以确定 菌株降解原油的最适温度。2、氧气：大多数石油烃类是在好氧条件下被降解的，因为许多烃类的 降解需要加氧酶和分子酶。但也有一些降解菌能在厌氧条件下降解石油 烃。3、营养盐：氮源和碳源经常成为微生物降解烃类的限制因子。在天然 水体中，为了促进石油烃类的降解而添加水溶性的氮源和碳源也受到限 制，因为有限添加的氮源和磷源在水体中被高倍稀释而难以支持微生物的 生长。目前微生物固定化技术逐渐得到应用， 成为解决寡营养盐的重要方 法。4、PH:石油烃类的微生物降解一般处于中性 PH值，极端的PH值环境不 利于微生物的生长。它的效率和质量还取决于石油烃类化合物存在的数量、种类及状态
9、。用浓度为0. 1mol/L的HCI或浓度为0. 1mol/L的NaOH 将无机盐培养基的pH值调整到5. 0、6. 0、7. 0、8. 0和9. 0,灭菌后 分别接种降解菌，于30C、200 r /min摇床上恒温培养，7 d后测定降解 体系中的原油降解率，以确定菌株降解原油的最适pH值。五、检测方法将复筛得到的菌种接种到含原油（质量浓度为85mg/L）的无机盐培养基 中，30 C、200 r /min摇床培养，利用紫外分光光度计测量残余油吸光度 值, 通过标准曲线换算出残余油的质量浓度 ,计算出降解率。六、参考文献 1 张博, 吴雁. 原油降解菌的筛选分离及其降解性能研 究.2007.11
10、(29) - 0102- 02 2 赵瑞雪, 刘淑梅, 郑笑秋. 石油烃类的微生物降解 .2006.29. 4 3 李丽 , 张丽萍 , 张元亮 . 石油烃类化合物降解菌的研究概况.(2001)0520089204 4 白洁，张竹圆，周方 . 石油烃降解微生物的研究进展 . 中国海 洋大学.2661 00 5 汪杰，郑维爽，礼晓，黄艺 . 高效石油降解菌的筛选鉴定及 修复能力研究 . 环境科学学报 .2010.30(6)1228-1234. 6 杨雪莲，李凤梅，刘婉婷，李刚 . 高效石油降解菌的筛选及 其降解特性 . 农业环境科学学报 2008,27(1):0230- 0233 7 王文琪，钱振儒 . 胶州湾水域异养细菌、大肠菌群和石油降 解菌的生态分布 . 中国科学院海洋研究所 .2000.24.1 8 任随周,郭俊, 邓穗儿, 岑英华,孙永革,孙国萍. 石油降解菌 的分离鉴定及石油污染土壤的细菌多样性 .2005.25.12. 9 张博,吴雁.原油降解菌的筛选分离及其降解性能研究 . 1000-2634(2007)-11-0102-02
