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1、精选优质文档-倾情为你奉上电转法设计方案一：感受态制备：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30、250-300rpm培养过夜；2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3. 于4离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4. 加入1ml，pH7.5，10TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5. 再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6. 于
2、4离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8. 每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70冰箱保存。电转化：1 向感受态细胞中加入约510ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2 擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；3 立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30静置1h；4 离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30、200rpm培养2h；5 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 u
3、l/板进行涂板。说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。设计方案二：感受态制备：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30、250-300rpm培养过夜；2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3. 于4，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc， 10 mM DTT， 0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，
4、pH 7.5），室温静置30min；4. 4，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5. 每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70冰箱保存。电转化：1. 向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2. 擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；3. 立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30静置1h；4. 离心，弃上清，加入1m
5、L YEPD后，于30、200rpm培养2h；5. 离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞具体如下：1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30、250-300rpm 条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；2. 取1mL菌液分装于E
6、P管中，于4，12000rpm离心30s，弃上清；3. 收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；4. 所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；5. 离心，弃上清，加入1ml 1M 预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；6. 最终用1M 预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70冰箱保存；7. 电转方法同上。8. 每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4条件下。醋酸锂转化法方案一：1. 挑一环酵母
7、菌接种于5mL YEPD培养基中，30、200rpm培养过夜；2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；3. 于4，5000rpm，5min离心收集菌体；4. 25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；5. 用1mL 0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；6. 再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；7. 依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：
8、50ul；8. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；9. 30水浴孵育30min；10. 42水浴热休克2025min；11. 13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30摇床孵育4h；12. 离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。方案二：1、 接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2107cells/ml；2、 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；3、 收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到1.5m
9、l离心管；4、 1ml TE/LiAC（10TE0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5；lOLiAc1 M LiAc pH 7.5）清洗细胞，然后用1TE/LiAC重悬至2109 cells/ml；5、 1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混合；6、 加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀；7、 30度振荡培养30min；8、 42度水浴热击15min；9、 离心5s，用1ml 1TE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。附：电转法方案二中的处量液配制方法：1. A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 m
10、M Tris-HCl，pH 7.5；配制量：500mL。1.1 称取54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中；1.2 事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中；1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中；1.4 用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4保存。2. B液成份（母液）：1 M DTT 配制量：20mL。2.1 称取3.09g DTT，加入到50mL小烧杯内；2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um滤器过滤除菌；2.3 适量分成小份后，-20保存。3. 在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液（A+B）。以50mL菌体为例：取A 液8mL ，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混匀，备用。专心-专注-专业
