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1、细胞培养的方法与步骤1. 开紫外灯前先擦超净台,台内紫外30分钟,室内紫外10分钟。同时将放在4C内 的培养液提前放置到室温。(可放在抽屉中,防止紫外照射)换液2. 先将培养液打开(开一层烧一层),放置在酒精灯旁。3. 将细胞从培养箱中拿出,进超净台前先要喷酒精。4. 打开培养瓶,烧瓶口,而后弯脖朝后,倒液,注意瓶口不要残留液体,若有残液要 用纱布擦净。5倒培养液(之前要烧瓶口),注意量(5m 1)不要再瓶口有残留液体是烧瓶口,否则 碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。6.倒一瓶封一瓶,迅速放平,培养瓶口拧紧后再松一下,放入培养箱中。传代2. 拿出细胞,开口,烧,倒液。3. (5ml大枪加3
2、ml)用PBS洗23遍(洗净血清,放置血清钝化胰酶)。4. 胰酶消化,37C5分钟(时间可自控)。消化程度是细胞不能滑落,要吹落。500微 升胰酶(4X, 1%) +1.5m1PBS-工作浓度0.25% (此时要用大枪)。5. (大枪)加入 3mlDMEM 完全培养液终止消化,用吸管缓慢吹打壁上的细胞(不要 让吸管的嘴端接触到瓶壁)6. 将混合物吸入离心管,加封口膜,离心500g 5分钟(此时洗去胰酶)在此期间PBS 洗培养瓶 3 遍, PBS 一定要吸净,否则加入培养液后会产生沉淀(培养瓶要重复使用,至少 100次)7. 倒掉上清,此时动作要轻或用大枪吸,加入3m1DMEM完全培养液重悬细胞
3、,用吸 管吹掉(再洗,清除胰酶)。8. 离心完毕,加入3ml新鲜培养液,再次吹打(约50100下,视细胞情况而定),防 止起泡沫,至细胞单个,圆球状为宜。9在培养瓶中加入新鲜培养液4ml,将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中(量依需要 而定)。 80微升, 100微升都可以。冻存8. 在冻存管中加入200微升冻存液,在离心管中加入1000微升冻存液,吹打(防止 起泡),移入冻存管中,此段时间不宜过久(DMSO对细胞伤害很大)。9. 封口膜封紧冻存管,可多封几层,用胶布缠紧,只缠一层就行,然后写字。10. 放在4C 30分钟。11. 放在冰水混合物中 10分钟。12. -20C中放置12小时(经验值
4、是不超过1.5小时)13. -70C中过夜,(最多可存放78个月)14. 放入液氮。注意: 传代前一天换液(可换可不换) 冻存前一天换液(必换) 血清灭活: 56C 30 分钟水浴。细胞培养相关用品:1. 84消毒液:1ml “84”用双蒸水进行稀释,只1000ml为止。2. 灭菌物品:至少包两层121C 20分钟3. PBS 灭菌时瓶口胶塞插针头,而不是用塑料袋包。以有利于加温后瓶内水蒸气能够 排出瓶外。4. 冻存液的配方:胎牛血清(FBS)20%DMSO10%(灭菌)双抗1: 1000稀释(保存浓度:1 X 100000u/ml)(工作浓度: 100u/ml)双抗是PG (青霉素)和ST(链霉素)5. 包板多需赖氨酸 0.1mg/ml室温 5min/板(5ml) 灭菌去离子水洗三遍。超净台吹干6. PBS 配方 0.1M (cell 培养用)1000ml500mlNacl8g4gKcl0.2g0.1gNa2HPO4.12H2O3.14g1.57gKH2PO40.24g0.12gPH值调到7.37.4之间