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1、细胞培养的方法与步骤1. 开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4C内 的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2. 先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。3. 将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。4. 打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要 用纱布擦净。5倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5m 1）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则 碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。6.倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。传代2. 拿出细胞，开口，烧，倒液。3. （5ml大枪加3
2、ml）用PBS洗23遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。4. 胰酶消化，37C5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微 升胰酶（4X, 1%） +1.5m1PBS-工作浓度0.25% （此时要用大枪）。5. （大枪）加入 3mlDMEM 完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要 让吸管的嘴端接触到瓶壁）6. 将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶 3 遍， PBS 一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少 100次）7. 倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3m1DMEM完全培养液重悬细胞
3、，用吸 管吹掉（再洗，清除胰酶）。8. 离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50100下，视细胞情况而定），防 止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。9在培养瓶中加入新鲜培养液4ml,将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要 而定）。 80微升， 100微升都可以。冻存8. 在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止 起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。9. 封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。10. 放在4C 30分钟。11. 放在冰水混合物中 10分钟。12. -20C中放置12小时（经验值
4、是不超过1.5小时）13. -70C中过夜，（最多可存放78个月）14. 放入液氮。注意： 传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56C 30 分钟水浴。细胞培养相关用品：1. 84消毒液：1ml “84”用双蒸水进行稀释，只1000ml为止。2. 灭菌物品：至少包两层121C 20分钟3. PBS 灭菌时瓶口胶塞插针头，而不是用塑料袋包。以有利于加温后瓶内水蒸气能够 排出瓶外。4. 冻存液的配方：胎牛血清（FBS）20%DMSO10%（灭菌）双抗1： 1000稀释（保存浓度：1 X 100000u/ml）（工作浓度： 100u/ml）双抗是PG （青霉素）和ST（链霉素）5. 包板多需赖氨酸 0.1mg/ml室温 5min/板（5ml） 灭菌去离子水洗三遍。超净台吹干6. PBS 配方 0.1M （cell 培养用）1000ml500mlNacl8g4gKcl0.2g0.1gNa2HPO4.12H2O3.14g1.57gKH2PO40.24g0.12gPH值调到7.37.4之间
