流式细胞术在药学中的应用

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1、流式细胞术在药学中的应用流式细胞技术(flow cytometry, FCM)是20世纪70年代初发 展起来的一项高新技术，利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析 和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和 电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。它可以高速分 析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、 精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。流式细胞仪根据基本功能不同可以分为流式分析仪和流式分选 仪1。流式分析仪可以对细胞或微粒上标记的荧光物质进行分析，从 而判定相应蛋白或核酸等物质的水平；而流式分选仪则可以在流式分 析的基础上

2、，将所需的细胞或微粒进行进一步分选，用于下游实验。 流式细胞仪主要由三部分组成：液流系统、光学系统、和电子系统； 流式分选仪还增加了分选系统。流式细胞仪的基本工作原理是：荧光 物质标记的单细胞悬液样品在一定压力下进入流动室，经鞘液包裹以 单细胞液流的方式经过检测区；细胞或微粒上所承载的荧光物质被激 光束照射，发射出散射光以及特定波长的荧光，并通过不同滤光片； 光信号在电子系统被转化为电信号，再转换为数字信号，经计算机分 析处理，直观地统计出染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。散射 光信号包括前向角散射光(forward scatter，FSC)和侧向角散射光(side scatter，SSC)

3、，FSC主要反映细胞大小，SSC主要反映细胞内颗粒的 复杂程度等2, 3。荧光信号的强弱则反映了相应检测物质(细胞内或 细胞外)的表达水平高低。生产流式细胞仪的主要厂家是美国的BD公司和贝克曼库尔特 (Beckman Coulter)两家公司，它们生产出一系列科研型和临床型的流 式细胞仪，并研制生产了 FCM所用的各种单克隆抗体和荧光试剂4。 事实上，在实验之初，详细分析待测标记物在细胞中的水平，综合考 虑标记物抗体、荧光强度、多色荧光补偿等各方面，合理选择荧光抗 体并设计实验，这对于流式检测十分重要3。应用流式细胞术的常用 实验包括细胞表面标志检测、细胞内蛋白包括细胞因子检测、细胞分 选、细

4、胞凋亡与周期检测、染色体倍体分析、荧光报告基因表达和转 染效率判定等基础和临床科学研究。我们课题组主要研究的是2型糖尿病与肠道菌群的关系，查文献 发现，T淋巴细胞是人体重要的免疫细胞群，外周血成熟T细胞主要 有CD4+和CD8+ 2个亚群，它们在体内进行免疫应答时互相协同， 又相互拮抗，以维持免疫应答的相对平衡，平衡失调会导致免疫功能 紊乱，产生一系列的免疫病理变化，也影响机体的免疫保护机制5-7。 CD4+ T细胞通过自身或调节其他免疫细胞分泌细胞因子而发挥作用， 各种细胞因子可直接导致胰岛P细胞损伤并参与胰岛素抵抗。其中分 泌的各种相关因子可通过各种途径造成组织损伤和肾脏纤维化，导致 糖尿

5、病肾病的发生。CD8+ T细胞具有抑制免疫细胞毒性效应的一种 T细胞，其降低使对CD4+ T细胞功能的抑制作用减低，从而促进 CD4+ T细胞对胰岛P细胞的损伤，加速糖尿病的发生发展8, 9。在一篇用流式细胞术检测T细胞在2型糖尿病中发病机制研究文 献中发现10，此项研究结果中，CD4+ T细胞亚群较对照组升高，而 CD8+亚群值明显低于对照组，提示2型糖尿病患者自身免疫调节功 能异常，即具有抑制免疫细胞毒性效应的T细胞减少，CD4+ T细胞 功能的抑制作用减弱，使辅助抗体产生的功能增强，自身抗体生成增 多，免疫调节紊乱，促进糖尿病的发生、发展。CD4+/CD8+比值是 临床上常用作了解机体细

6、胞免疫功能的敏感指标。此项研究中， CD4+/CD8+比值明显升高，提示2型糖尿病患者存在明显的细胞免 疫功能异常，这可能与CD8+ T细胞减少关系较大，故CD8+ T细胞 减少在此细胞免疫缺陷中居主导地位。这种由T淋巴细胞介导的免疫 异常可造成对胰岛B细胞的损伤，可能在2型糖尿病的发生、发展中 起重要作用。糖尿病肾病患者外周血CD4+ T淋巴细胞较2型糖尿病 组升高且差异有统计学意义，提示CD4+ T淋巴细胞可能参与糖尿病 肾病的发生。流式细胞术也可用于各种基因表达蛋白的定量、定性研究，选择 不同的单克隆抗体及荧光染料，可以利用流式细胞仪同时测定一个 细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣，还可 以利用流式的分选功能将其分选出来，以便进一步培养、研究。所以 说，流式细胞术在药学专业中对某些细胞、蛋白机制的研究有重要应 用。