液相基本术语及操作

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1、液相色谱检测1仪器的基本常识及术语1.1仪器结构：液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器；1.2 仪器分类：液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器；按照分为离机制，吸附、分配、离子交换、亲和色谱，体积排阻色谱； 按照流动相与固定相的极性，分为正相色谱法和反相色谱法；122 高效液相色谱法的应用围：高效液相色谱法适用于高沸点不易 挥发、受热不稳定易分解、分子量大的，不同极性的有机化合物，生 物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。1.3仪器检定：液相色谱仪检定周期为1年，在两次检定间期进行一次 期间核查，也可以根据情况增加核查次数；1.4维护保养：对于液相维护方式主要是周维护和

2、日维护，其中周维 护包括联机系统及中工作站软件维护、数据库整理备份、检测器自检、维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗 等；日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样 口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉 淀；1.5色谱法的常用基本术语基线：在色谱操作条件下，没有被测组分通过鉴定器时，记录器所记录的 检测器噪声随时间变化图线称为基线 .死时间，保留时间及校正保留时间：从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间，以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间，以tr表示.保留时间与死时间之差称校正保留时间以Vd表示.死体积，

3、保留体积与校正保留体积：死时间与载气平均流速的乘积称为 死体积，以Vd表示，载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气平 均流速的乘积称保留体积，以Vr表示,Vr=trxFc峰面积：流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积，用A表示. 拖尾因子：是反映峰对称性的指标，计算公式：拖尾因子T=W0.05h/2d1 (其中W0.05h为5%筆高处的峰宽，di为峰顶点至峰前沿 之间的距离)。峰高与半峰宽：由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交 点间的高度称为峰高，一般以h表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽，-般以x1/2表示；1.7色谱检测的特性(1) 灵敏度高；(2) 线性围宽

4、；(3) 分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系：(4 )分离度与柱效的平方根成正比，选择因子一定时，增加柱效；(5) 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化：一般通过改变固定相和流动 相的性质和组成或降低柱温，可增大选择因子；(6) 增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。对于液相色谱，改变流动相的组成，可以有效控制k ；2仪器的操作规程2.1日立液相设备 L-2000/2400操作规程2.1.1使用环境环境温度：4 C 55 C；相对湿度：小于95%RH2.1.2使用前准备检查所用溶液(如流动相，乙腈等)是否足够。 检查线路是

5、否连接正常。2.1.3设备操作方法具体操作如下：(1) 依次开启泵开关，检测器开关，自动进样器开关， 柱温箱开关；(2) 打开软件，点击“i”按钮，出现联机界面，点击initialize ”ni?aiz按钮，当文本框出现文字时，表示联机成功;(3) 检查所用方法是否符合要求。如不符合，进行设置；开泵。检测具体操作如下：(1) 建立所需样品盒；(2) 点击检测按钮，选择刚建立的样品盒；(3) 首先进行走基线；(4) 当基线走平时，点击系列样品检测按钮，进行标样，样品检测;(5) 当标样检测结果出来时，打开结果窗口，选择所需标样结果，点击“ Recalculateri:k ?Ikjuleit进行重

6、新计算，然后点击“ Calibration ” k? librei ?i进行定标；(6) 当样品结果出来时，打开结果窗口，选择所需样品结果，点击“Recalculate ” ri:k ? lkjuleit进行重新计算，然后点击ModifyReport ” m?difai, rip?:t,，出现结果报告，即可查看样品具体结果。2.1.4更换流动相具体操作如下：(1) 当流动相快不够时或异常时，及时更换流动相；(2) 先把泵关闭，将流动相入口放入新流动相中；(3) 将泵阀逆时针旋转，进行排气。大约3分钟后，关闭排气功能；(4) 排气完毕后，将泵阀顺时针旋转拧紧，开泵；(5) 走基线，当基线走平时，

7、开始做标样，做样。2.1.5关机具体操作如下：(1) 先把泵关闭，将流动相入口更换为超纯水；(2) 将泵阀逆时针旋转，进行排气。大约3分钟后，关闭排气功能；(3) 排气完毕后，将泵阀顺时针旋转拧紧，开泵；(4) 用超纯水冲洗管路大约20分钟；(5) 把泵关闭，将超纯水更换为100%甲醇或100%乙腈；(6) 将泵阀逆时针旋转，进行排气。大约3分钟后，关闭排气功能；(7) 排气完毕后，将泵阀顺时针旋转拧紧，开泵；(8) 用100%甲醇或100%乙腈冲洗管路大约30分钟；(9) 关泵，关液相软件，关泵开关，检测器开关，自动 进样器开关，柱温箱开关。2.1.6维护保养、注意事项(1) 进行旬维护检查

8、工作，主要检查事项：软件是否正常、温度、 清洗、进样器、泵单元；(2) 每次测量前进行标样检测，斜率达到99.99%要求才能检测样品，测完样品及时清理。(3) 按要求进行每天2个小时以上的清洗。2.2 Waters 高效液相色谱-2695/2489 2.2.1开机自检具体操作如下：(1) 打开 Alliance ?lai ?ns 2695 和 2489 的电源开关至 ON (1)的位 置，仪器开始进行自检；(2) 仪器将进行大约5分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后，出现以下画面，画面上方的状态显示区会出现“Idle ” aidl状态，表示开机测试正常。2.2.2流动相有机溶剂要求用色谱纯(进

9、口名牌最好)，水或缓冲盐溶液要用超纯 水(电阻率：18.2M Q),每48小时制备新鲜的水相流动相，尤其是100%含 水流动相使用时间不超过两天。6根管子都在液面以下。溶剂的位置必须高于溶剂混合阀(Gradient Proportioning Valve)。greidi?nt pr?p?:?ni? v? Iv清洗柱塞密封垫(Seal Wash) si:i w?的溶液：含5% 10%甲醇的超 纯水。洗针液(Needle Wash) ni：d?iw?|: 50%甲醇：50%水(该比例仅适用 于反相试验)。注：以上溶剂或溶液均需用0.45 pm的膜过滤并超声脱气1分钟，用 洁净的玻璃容器盛放，避免污

10、染，同时玻璃容器应用超纯水来清洗而不 能用自来水。2.2.3灌注柱塞密封清洗清洗操作步骤：回到Menu menju：画面，选择Diag ;(2) 确定Seal Washsi:l w?的管路放在正确的位置；(3) 按 Prime Seal Wash praim si:i w ?习，再按 Start，直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管，按Halt; h?:lt(4) 按 Close。注意：密封圈清洗(Seal wash) si:i w?|溶剂，在反相液相色谱中可 使用 Water/MeOH methyl alcohol 甲醇 =90/10 或 Water/Acetonitrile? sit?un

11、aitril乙腈=95/5(根据实际需要使用不同溶剂)。2.2.4灌注针头清洗操作步骤：回到Main mein的画面，选择Diag ,选择Prime praim Ndl Wash。设定值为30秒，若想要多清洗几次时，请按 Start Again。清洗溶剂：50%的甲醇溶液注意：若上述清洗溶剂无法避免进样时的交叉污染，使用较强的 溶剂系统来进行清洗操作。2.2.5打开真空脱气机如液相仪管路干，可进行使用，如管路不干则按照以下步骤进行操作：按“Menu/Status ” steit?s键，进入Status (1)画面；利用方向键将 光标移至“ Degasser ” di：g?s?位置，按Enter

12、 ;利用上下键选择模式为 ON。注意：在开启除气装置时，要确认所有溶剂管路都充满溶剂；若没有溶剂时请执行溶剂的Dry Prime drai praim操作。226执行干灌注确定流动相溶剂的管子放在正确的位置，检测器(Detector ditekt?)废液管及定量环(Sample Loop iu：p)的废液管是否放置于适当的废液容 器中。摇动溶剂瓶的过滤器(Solvent Filter) s?iv?nt fiit ?，防止气泡附着在 过滤器的外表面。将空的针筒插入抽液阀(Prime/Vent value)中，以逆时针的方向旋 转3圈。按 Menu/Status ” steit?s键，进入 Sta

13、tus(1)画面，按 Direct Function ” direktf?k?n功能键，选择 Dry Prime，按 Enter。按下面使用的溶剂开启阀门(例如:Open A)，然后将针筒向外拉， 抽出510mL溶剂并完全抽出溶剂管子的气泡，完成后关闭 Prime/Vent 阀门。在 Enter a duration ” djurei ?n中输入 3分钟，按 “Continue ” 键，泵 即以3.0mL/min的流速进行清洗(Purge)。可重复上两个步骤，将所要使用的流动相溶剂Dry Prime。2.2.7执行湿灌注按Menu/Status ”键，进入Status(1)画面，利用方向键将光

14、标移至 Composition ” k?mp?zi?n字段，将欲 Wet Prime 的溶剂输入 100%按 Direct Function ” direkt f?k?n功能键，选择 Wet Prime ,按 Enter。Wet Prime 的原设定值，一般为 Flow Rate:7.5mL/min , Time: 3.0min，然后按下“OK”键，泵即开始进行Wet Prime操作。重复上述的步骤直到所有溶剂Wet Prime进行完毕。2.2.8设定流动相平衡色谱柱按Menu/Status ”键，进入Status (1)画面，利用方向键将光标移 至Composition ” k?mp?zi?

15、n字段，利用仪器面板右侧的数字键设置试 验要求的溶剂组成比例，此时会在原溶剂比例表的下方出现新编辑溶 剂比例表(New Composition)。设定好新的溶剂组成比例后，按Change Comp ” t?eind? k?mp功能键(改变溶剂组成比例change composition),此设定的溶剂组成比例即为当前的比例。利用方向键将光标移至“ Flow” fi?u字段，利用仪器面板右侧的数 字键设定流速，此时仪器即设定的溶剂组成比例和流速来平衡色谱柱。特别提示：对于常规的反相色谱试验至少要用30倍柱体积来平衡，而对于离子对色谱的平衡可能需要多达500柱体积的流动相来平衡。229冲洗进样器溶齐 管理系统的前处理 (Prime the solvent management system) 要求如下：(1) 改变溶剂；(