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1、 专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进展严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进展设计和施工的，又叫做DNA重组技术。一基因工程的根本工具1.“分子手术刀限制性核酸切酶限制酶1来源：主要是从原核生物中别离纯化出来的。2功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。3结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针DNA连接酶(1)两种DNA连接酶Ec
2、oliDNA连接酶和T4-DNA连接酶的比拟：一样点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“分子运输车载体1载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。2最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简
3、单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。3其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的根本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。直接别离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。1原理：DNA双链复制2过程：第一步：加热至9095DNA解链；第二步：冷却到5560，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目
4、的基因启动子终止子标记基因1启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。2终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。3标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞，并且在受体细胞维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显
5、微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是 大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为 感受态细胞 ，再将 重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探
6、针与mRNA杂交。目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的 抗体进展抗原抗体杂交。 个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。三基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体，使该基因表达产物发挥作用。四蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律与其生物功能的关系作为根底，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进展改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。基因工程在原如此上只能生
7、产自然界已存在的蛋白质转录 翻译蛋白质工程的根本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。根本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列基因以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进展。注意：目的基因只能用人工合成的方法专题2 细胞工程一植物细胞工程 1.理论根底原理：细胞全能性全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞1过程：离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 试管苗 植物体2用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。A 植物繁殖微型繁殖
8、：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒因为植物分生区附近的病毒极少或没有 人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输B 作物新品种培育单倍体育种：a过程：植株AaBb通过减数分裂得到花粉AB、Ab、aB、ab四种类型；对花粉进展花药离体培养技术是植物组织培养；得到单倍体植株；对其幼苗时期进展秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株AABB、AAbb、aaBB、aabb四种类型。b 优点：明显缩短育种年限C 突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从
9、有用的突变体中选育出新品种如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体D 细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进展组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。3地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。1过程：2诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇PEG作为诱导剂。3意义：克制了远缘杂交不亲和的障碍。二动物细胞工程1. 动物细胞培养1概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。2动物细胞培养的流程：取动物组织块动物胚胎或幼龄动物的器官或组织剪碎用胰蛋白酶或胶原
10、蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进展原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。3细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到外表相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。4动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进展无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代产物积累对细胞自身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需参加血清、血浆等天然成分。温度：
11、适宜温度：哺乳动物多是；pH：。气体环境：95%空气5%CO2。O2是细胞代所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。5动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。1哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植比拟容易和体细胞核移植比拟难。2选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比拟大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。3体细胞核移植的大致过程是：右图 高产奶牛提供体细胞进展细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核显微操作注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达；将供
12、体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体代孕母牛体；生出与供体奶牛遗传基因一样的犊牛核移植胚胎移植4体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。5体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。1动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。2动物细胞融合与植物原生质体融合的原理根本一样，诱导动物细胞融合的方
13、法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。3动物细胞融合的意义：克制了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。4动物细胞融合与植物体细胞杂交的比拟：细胞工程植物体细胞杂交动物细胞融合理论根底细胞的全能性、细胞膜的流动性细胞增殖、细胞膜的流动性融合前处理酶解法去除细胞壁纤维素酶、果胶酶注射特定抗原，免疫处理正常小鼠诱导手段物理法:离心、振动、电激 物理法:离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇 化学法：聚乙二醇PEG生物法：灭活的病毒灭活的仙台病毒诱导过程第一步：原生质体的制备 酶解法 正常小鼠免疫处理动物细胞的融合
14、物、化、生法第二步：原生质体融合 物、化法 杂交瘤细胞的筛选与培养 专一抗体检验阳性细胞培养 第三步：杂种细胞的筛选和培养 单克隆抗体的提纯第四步：杂种植株的诱导与鉴定用途和意义克制远缘杂交的不亲和障碍1 制备单克隆抗体 大大扩展杂交的亲本组合围 2 诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹治疗癌症应用：白菜-甘蓝等杂种植株注入小鼠细胞融合别离抗原注入小鼠体内B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养选择培养细胞培养基体内培养体外培养从腹水提取从培养液提取单克隆抗体1抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中别离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。2单克隆抗体的制备过程：3杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。4单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。5单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹，也有少量用于治疗其它疾病。专题3 胚胎工程
