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1、项目二十一细胞因子检测一、白细胞介素-2的测定(Determination of interleukin-2)检测IL-2主要有两类方法，一类是生物活性检测，另一类是抗体检测法(或称为免疫分 析法)。生物活性检测法是通过检测IL-2反应敏感细胞对待检样本中IL-2的增殖反应程度对 IL-2进行分析，该方法比较敏感，但检测时间长，步骤多，影响因素多，因此结果容易波动。 免疫分析法比较简单、迅速、可靠，通过免疫分析法检测IL-2的方法也有很多，其中应用 较多的是采用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunoabsobent Assay, ELISA)这里选取其 中较为实用、敏感性及
2、特异性较好的双抗体夹心法加以介绍。【实验原理】将抗IL-2单抗结合到固相载体上形成固相抗体，然后通过加入待检标本，使标本中的 相应抗原IL-2与抗体结合形成免疫复合物，洗涤后加入生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体， 使之与免疫复合物中的IL-2抗原反应，再加入亲和素标记辣根过氧化物酶进行反应，最后 加底物显色，通过分析酶促反应强度检测标本中IL-2的含量。【试剂与器材】1. 抗体和标记物 包被用抗人IL-2单克隆抗体，生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体， 亲和素标记辣根过氧化物酶。2. 包被缓冲液 0.1mol/L Na2HPO4，用 HCl 调整 pH 值至 9.0。3. PBS 80.0g
3、 NaCl，11.6g Na2HPO4，2.0g KH2PO4，2.0g KCl，溶解于 10L 蒸馏水中， 调整pH至7.0。4. 洗涤液 含 0.05%(V/V)Tween-20 的 PBS，pH 值 7.0。5. 封闭液 含10%(V/V)小牛血清或1 % BSA (W/V)的PBS液。6. 样品稀释液 用封闭液加入0.05 %(V/V) Tween-20即可。7. 底物 加150mg 2,2-连氮基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)于500ml 0.1mol/L枸橼酸溶液中，充分溶解后用NaOH调节pH值至4.35,分装后保存于-20C备用。 用前每11ml底物溶液
4、中加入H2O2 10叫。8. 终止液 20%SDS-50%DMF(将 50ml DMF加入到50ml蒸馏水中，然后加入20.0g SDS)。9. 温箱、聚苯乙烯酶标反应板、微量移液器、酶标检测仪。【步骤与方法】1. 包被 用包被液稀释鼠抗人IL-2单抗至适当浓度，加到聚苯乙烯酶标反应板中，每 孔100gl，最后一孔仅加包被液100gl作为对照，加盖或用塑料粘纸封板，4C作用过夜。2. 封闭 弃去包被液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，每孔加封闭液200gl，室温作 用1h。如不立即检测样品，可保留封闭液而置于4C备用。3. 加样 弃去封闭液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，加用稀释液稀释的IL-2
5、标准 品或标本液，每孔100gl，室温作用24h或4C过夜。4. 加二抗 弃去样品液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，加用样品稀释液适当稀释 的生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体，每孔100gl，室温作用1h。5. 加亲合素-HRP弃去多抗液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，加用样品稀释液适 当稀释的亲和素标记辣根过氧化物酶，每孔100gl，室温作用3060min。6. 显色 弃去亲和素-HRP反应液，用洗涤液洗涤反应孔8次，甩干，加底物，每孔 100gl，室温避光显色560min,或据室温适当缩短或延长反应时间，至阳性孔出现明显棕 黄色时加终止液，每孔50gl，终止反应。【结果判定】1. 目测法
6、 阳性孔呈桔黄色至棕黄色，阴性孔为无色或极浅的黄色。如需定量测定， 应采用比色法。2. 比色法 以空白对照调零，用酶标检测仪测A405值，画出标准曲线，并据标准曲线 确定样品中IL-2的含量。【注意事项】1. 应首先通过方阵滴定确定各抗体的最佳浓度，再进行正式实验。其中包被抗体浓度 一般以1却g/ml为宜，而生物素标记二抗浓度以0.252.0pg/ml为宜。2. 检测标本应力求新鲜，污染细菌的标本容易产生非特异显色，因菌体内可能含有内 源性HRP。如需检测血标本，应避免溶血，因红细胞溶解后会释放出具有过氧化物酶活性 的产物。3. 为确保结果准确，应常规设重复孔，如一次用多块板进行实验，应考虑板
7、间差异。 在每块板上均应设立对照孔，尤其是每板都应设阴性对照。4. 切忌加底物前将反应板暴露于空气中时间过长，不可将许多板一次甩干后再依此加 入底物。【方法评价】本法一般用于定量检测细胞培养上清液标本中IL-2的含量，其敏感性和特异性均较高， 缺点是操作步骤较多，容易受到抗体浓度、抗体对包被固相的吸附能力及酶标抗体质量的影 响，因此应在充分预实验的基础上，确定各抗体的最佳稀释度，以达到最佳检测效果。本方 法亦可用于标本中其它多种细胞因子测定，故目前应用十分广泛。也可以在步骤3之后先加 普通兔抗人IL-2多抗反应，再加生物素标记羊抗兔IgG进行后续实验，这样反应用试剂更 易制备，方法也更易使用。
8、【临床意义】IL-2是由T淋巴细胞产生的一种具有多种生物学活性的细胞因子，它在免疫应答和免 疫调节过程中具有重要作用。本方法可以直接检测标本中IL-2的含量。【思考题】检测IL-2的方法有哪些，各自具有何优缺点？二、肿瘤坏死因子活性的测定(Tumor necrois factor bioarray)【实验原理】L929细胞株是对肿瘤坏死因子(TNF)很敏感的小鼠纤维瘤细胞株，当体外用TNF刺激 时，其死亡率与TNF活性成正比。结晶紫染料能使存活的细胞着色，再用脱色液将染料溶 解后测定其吸光度，测定值与残留的存活瘤细胞数呈正相关，而与TNF的活性呈负相关。 放线菌素D能抑制DNA的合成，降低瘤细
9、胞对损伤的修复，加入之可使靶细胞对TNF的 敏感性提高10100倍。【试剂和器材】1. L929细胞选择生长良好的对数生长期细胞，用终浓度0.01%胰蛋白酶消化收集， 用RPMI 1640培养基配成2x105/ml的细胞悬液待用。2. 胰蛋白酶 取胰蛋白酶2.5g、EDTA 0.2g、无Ca2+和Mg2+的Hanks液1000ml，过滤 除菌，分装后置-20C保存。3. RPMI 1640培养液 含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100gg/ml链霉素。4. 放线菌素D 用RPMI 1640培养液配成100|ig/ml的浓度。5. 脱色液 由9g/L柠檬酸钠、0.02mol/LHCl和4
10、7.5%甲醇组成。6. 重组TNF标准品和待检样品。7. 2.5 g/L结晶紫染液 溶于20%甲醇。8. 酶标测定仪、CO2培养箱、微量加样器、细胞培养瓶、细胞培养板。【步骤和方法】1. 取96孔细胞培养板，每孔加入100gl L929细胞悬液，置37C5%CO2培养箱中培养 24h。2. 吸去培养细胞的上清液，加入倍比稀释待检样品和TNF标准品(1000.1U/ml),每 孔100皿，各设双复孔；阴性对照孔加入100gl RPMI 1640培养液，并设空白对照组。同时 向各孔加入10gl放线菌素D(0.51.0pg/ml)，置37C5%CO2培养箱中培养1214h。3. 离心弃上清液，用PB
11、S洗细胞一次。4. 每孔加2.5g/L结晶紫100gl，置室温染色10min。5. 离心弃上清液，用PBS洗一次。6置室温晾干，每孔加入脱色液100gl，充分混匀后测A570或A630值。【结果判定】1. 毒性百分率按下式计算：细胞毒性=(1一叫实验组A值店)100% 阴性对照组A值2. TNF活性单位定量 以标准品A值为纵坐标，活性单位(U/ml)为横座标作图，各检 测标本通过A值在标准曲线上可查出相应的活性单位数。【注意事项】1. L929细胞不宜生长过密，只要孔内长成单细胞层即可使用。2. L929细胞随着传代或受其它因素影响，对放线菌素D的敏感性会有差异， 故最好先做预试来确定其使用浓度。3. TNF活性单位标准曲线如不理想，可用对数处理，将曲线直线化。【方法评价】本方法的优点是较为直观，能反映TNF的生物活性。缺点是敏感性较低，需长期饲养 靶细胞株。【临床意义】许多疾病TNF可出现异常，如感染性疾病(尤其是重症感染)、自身免疫病、移植排斥 反应、某些肿瘤等。检测TNF可用于某些疾病发病机理的探讨、疾情监测及预后或辅助诊 断。【思考题】1. TNF还有哪些检测方法？各有何优缺点？2. TNF测定中加放线菌素D的意义何在？
