猴樟根系适应碱胁迫的代谢组学分析1)

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1、 猴樟根系适应碱胁迫的代谢组学分析1) 韩浩章 张丽华 李素华 赵荣 王芳(宿迁学院,宿迁,223800)猴樟(CinnamomunbodinieriLevl.)为樟科、樟属常绿乔木,多分布于云南、贵州、湖南西北部、四川东部、湖北等省分的山地、林区和城市道路,是我国重要的林用、绿化和经济树种1。我国关于猴樟的研究起步较晚,前人通过对猴樟生长特性的分析,明确了猴樟作为绿化树种进行应用的可能性2-3,但我国许多地区苗圃建设和城市绿化过程中栽培土壤质量较差,因建筑垃圾回填等原因使得土壤pH在8.49.0之间,土壤密度大,有机质质量分数低,矿质营养元素缺乏,直接影响猴樟的生长发育。苗木栽植后普遍表现为

2、生长缓慢、叶片黄化、抗性降低等,生产栽培过程中采用的人工换土、药液灌根、树干挂水、叶面喷肥等措施的效果也并不理想4,因此限制了猴樟的推广应用。当植物暴露于非生物胁迫时,可以通过调节由信号、基因、功能蛋白、代谢物及表型组成的复杂系统来维持体内生长过程,其中代谢物被认为是连接表型和基因型的桥梁,能及时反映植物的生理状态。代谢组学分析能检测并筛选出逆境条件时植物体内具有重要生物学意义和统计学显著差异的代谢物5-6,已广泛用于不同物种的逆境胁迫机理研究。Goufo et al.7发现,在豇豆(Vignaunguiculata)根中,氨基酸、可溶性糖以及原花青素的积累,与干旱胁迫起始阶段的感知密切相关。

3、盐胁迫时,西伯利亚白刺(Nitrariasibirica)根部,-氨基丁酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苹果酸、草酰乙酸及延胡索酸等代谢物质量分数明显增加8。Lu et al.9研究表明,高羊茅(Festucaarundinacea)和星星草(Puccinelliatenuiflora)中,酮戊二酸、乌头酸、脯氨酸、可溶性糖和山梨糖等代谢物在混合盐碱胁迫时大量积累。从代谢通路来看,盐胁迫时,多年生黑麦草(Loliumperenne)显著差异代谢物主要富集于淀粉和蔗糖代谢通路、半乳糖代谢通路、丝氨酸和苏氨酸代谢通路、乙醛酸和二羧酸代谢通路、光合碳循环代谢通路等10。棉花(Gossypiumhirsutu

4、m)在盐碱胁迫时,代谢产物变化最明显的代谢通路是色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢与柠檬酸循环(TCA循环)11。由此可见,代谢组分析为植物适应逆境胁迫的分子机理研究提供了新的证据。樟属植物遗传多样性丰富,种间耐碱性差异较大,目前关于樟属植物耐碱机理研究仍较少12。我们前期的转录组分析表明,碱敏感猴樟叶片苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路、精氨酸和脯氨酸代谢通路、异喹啉生物碱生物合成通路、植物病原菌互作通路、类胡萝卜素生物合成通路等相关基因表达量在碱胁迫时明显上调13,但对猴樟根系适应碱胁迫的机制并不了解。因此,本研究以猴樟根系为研究对象,采用水培培养技术,研究碱胁迫时代谢物的积累和代谢途径,

5、以期从代谢组学角度,为解析猴樟适应碱胁迫的分子机理提供参考。1 材料与方法试验材料:试验在宿迁学院樟属植物种苗基地进行,于2020年8月采种,低温层积后,于2021年2月播种,选择正常生长、长势一致的猴樟幼苗为试验材料,苗高(302)cm。试验设计:试验采用水培培养技术,将幼苗移入塑料水培箱(营养液体积为38 L)中培养,营养液配方为0.5倍的霍格兰营养液,采用蒸馏水进行配制,采用KT板(厚度为2 cm)进行固定,期间采用增氧泵24 h充氧。试验设2个处理,材料培养3周后,根据课题组前期研究,向各处理营养液中加入Na2CO3,浓度分别为0(对照)、20 mmol/L(浓度30 mmol/L则出

6、现幼苗逐步死亡现象)14,营养液pH分别为7.58、9.49。分别于处理之后的6、48 h随机选取各重复幼苗根部须根系,分别标注为HCK6(对照处理6 h)、HT6(Na2CO3处理6 h)、HCK48(对照处理48 h)、HT48(Na2CO3处理48 h),液氮速冻后,于-80 冻存,每处理3个生物学重复。代谢物提取、检测:取液氮研磨后的样品40 mg,参考郭家鑫等11的方法进行代谢物提取,采用超高效液相色谱系统(岛津,LC-30)进行分离,采用质谱仪(赛默飞世尔科技公司QE Plus)进行质谱分析。数据质量与稳定性验证:采用MS-DIAL软件完成原始数据的基线对齐、保留时间矫正和解卷积等

7、工作。采用精确质量数匹配(质量偏差1;(2)单变量统计分析结果(P值)0.05。依据HMDB数据库对各比较组的差异代谢物进行分类统计,采用京都基因与基因组百科全书(KEGG)系统进行通路分析。对差异代谢物的注释结果进行差异丰度得分的计算,利用差异丰度得分对代谢通路进行整体趋势分析。当差异丰度得分为-1时,表示该通路中所有代谢物的丰度均下降,当差异丰度得分为1时,表示该通路中所有代谢物的丰度均上升,越趋近于1或-1,表示该通路整体表达情况越倾向于上调或下调。2 结果与分析2.1 碱胁迫时猴樟根系差异代谢物筛选图1为HT6和HCK6、HT48和HCK48组合正、负离子模式的OPLS-DA分析结果,

8、横坐标上预测主成分以0为中心点,将各组合中的两组样品明显分离开,说明各组合中样品组间代谢物表达量差异显著。A为HT6和HCK6正离子模式;B为HT6和HCK6负离子模式;C为HT48和HCK48正离子模式;D为HT48和HCK48负离子模式。由碱胁迫处理6、48 h的猴樟根系显著差异次生代谢产物韦恩图可知,碱胁迫处理6 h时,HT6和HCK6组合共鉴定到正离子模式差异显著的次生代谢产物126个,鉴定到负离子模式差异显著的次生代谢产物143个,共计269个;碱胁迫处理48 h后,HT48和HCK48组合共鉴定到正离子模式差异显著的次生代谢产物194个,鉴定到负离子模式差异显著的次生代谢产物166

9、个,共计360个。两组共有的差异代谢物分别是正离子模式95个和负离子模式99个。碱处理48 h后的表达量差异显著次生代谢产物数量比碱处理6 h的增加了91个,其中正离子模式的增加了68个。2.2 碱胁迫时猴樟根系差异代谢物分类由表1、2可知,当碱胁迫处理6 h时,HT6和HCK6组合正离子模式表达差异代谢物主要包括生物碱类、聚酮类、苯丙素类和萜类;负离子模式差异代谢物包括萜类、核酸、聚酮类、有机酸类、生物碱类、碳水化合物和脂类。当碱胁迫处理48 h时,HT48和HCK48组合正离子模式差异代谢物主要包括生物碱类、聚酮类、类固醇类、苯丙素类、甾醇类酯和萜类;负离子模式差异代谢物包括聚酮类、萜类、

10、生物碱类、核酸、抗生素和脂类。表2 碱胁迫6、48 h时猴樟根系负离子模式差异代谢物种类2.3 碱胁迫时猴樟根系差异代谢物KEGG通路分析在植物体中,多种代谢物通常相互协调完成不同的生物学任务,差异丰度得分可以捕捉到通路中整体代谢物相对于对照组增加或减少的趋势。由表3可知,碱胁迫处理6 h时,HT6和HCK6组合中能鉴定出差异代谢物主要富集的30条KEGG通路,其中嘧啶代谢通路和玉米素生物合成通路最为显著;由表4可知,富集的30条KEGG通路中,大部分显著下调或趋于下调,只有脂肪酸生物合成通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路显著上调,而托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成通路、嘧啶代谢通路、磷酸

11、转移酶系统(PTS)通路和苯丙烷生物合成通路趋于上调,其余通路无明显变化。表3 碱胁迫6 h时猴樟根系差异代谢物KEGG通路分析结果表4 碱胁迫6 h时猴樟根系差异代谢物KEGG通路的差异丰度得分如表5所示,碱胁迫处理48 h时,HT48和HCK48组合中,能鉴定出差异代谢物主要富集的30条KEGG通路,其中醛固酮合成与分泌、皮质醇合成和分泌、库欣综合征、卵母细胞减数分裂、孕酮介导的细胞成熟、胆汁分泌、嘧啶代谢、胰岛素抵抗、黄酮类生物合成、光合生物的固碳作用、卵巢类固醇激素生成、黄酮和黄酮醇生物合成通路最显著;如表6所示,富集的30条KEGG通路中只有半乳糖代谢通路和黄酮类生物合成通路趋于上调

12、,而托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成通路整体无显著变化,其余通路均显著下调或趋于下调。表5 碱胁迫48 h时猴樟根系差异代谢物KEGG通路分析结果表6 碱胁迫48 h时猴樟根系差异代谢物KEGG通路的差异丰度得分2.4 碱胁迫时猴樟根系差异代谢物质量分数变化由表7可见,碱胁迫处理6 h时,HT6和HCK6组合中鉴定出脂肪酸生物合成通路中的丙二酸、月桂酸、棕榈酸、亚油酸质量分数显著上升;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路中N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、草酰乙酸、2-氧代丁酸质量分数显著上升;托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成通路中的千里光碱和东莨菪碱质量分数显著上升,胡椒碱质量分数显著下降;嘧啶代谢通路中尿

13、苷5-二磷酸、尿苷、尿嘧啶、丙二酸质量分数显著上升,尿苷一磷酸(UMP)的显著下降;磷酸转移酶系统通路海藻糖、N-乙酰氨基甲酸质量分数显著上升,水杨苷质量分数显著下降;苯丙烷生物合成通路中的苹果酸芥子酰、丁香素质量分数显著上升;半乳糖代谢通路中的水苏糖质量分数显著上升,UDP-葡萄糖质量分数显著下降;黄酮类生物合成通路中的高圣草素、(-)-表儿茶素、松木素质量分数显著下降。表7 筛选出的关键差异代谢物碱胁迫处理48 h时,HT48和HCK48组合中鉴定出脂肪酸生物合成通路中的月桂酸、棕榈酸、亚油酸、硬脂酸质量分数显著上升;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路中草酰乙酸质量分数显著上升,-氨基丁酸(

14、GABA)质量分数显著下降;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路中的莽草酸质量分数显著上升,D-赤藓糖-4-磷酸质量分数显著下降;托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成通路中的千里光碱和东莨菪碱质量分数显著上升,胡椒碱质量分数显著下降;嘧啶代谢通路中尿苷5-二磷酸质量分数显著上升,尿苷一磷酸质量分数显著下降;磷酸转移酶系统通路水杨苷质量分数显著下降;半乳糖代谢通路中的蜜二糖、水苏糖质量分数显著上升,UDP-葡萄糖质量分数显著下降;黄酮类生物合成通路中的阿夫儿茶素、槲皮素、高圣草素质量分数显著上升,(-)-表儿茶素、松木素质量分数显著下降。3 结论与讨论植物在逆境胁迫的基因表达与环境因素共同作用,伴随

15、代谢通路和代谢物质量分数的变化,代谢物积累既有时空积累的特异性,又存在适应逆境的多样性。目前,已发现许多代谢物在盐胁迫时显著上调,盐胁迫明显提高了狗牙草(Cynodondactylon)氨基酸、可溶性糖、有机酸以及可溶性糖醇等37种代谢物的质量分数15;油菜(Brassicanapus)通过促进三羧酸循环,积累糖类和肌醇代谢物,适应盐胁迫16;椰子(Cocosnucifera)在盐胁迫时,黄酮类代谢物质量分数及其合成相关的基因表达量明显提高17,这些代谢物的积累有利于维持植物胞内渗透调节、清除氧化损伤和稳定蛋白质功能。最近的代谢组分析发现,植物根系适应盐胁迫和碱胁迫的机理存在差异,生物碱和类胡萝卜素参与了垂丝海棠(Malushalliana)适应碱胁迫18;棉花(Gossypiumhirsutum)主要通过三羧酸循环代谢、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢通路适应碱胁迫11。与对照相比,碱胁迫处理6 h时,猴樟根系共鉴定到表达量差异显著的次生代谢产物269个,包括生物碱类、聚酮类、有机酸类、核酸、苯丙素类和萜类等;碱胁迫处理48 h时,共鉴定到表达量差异显著的次生代谢产物360个,主要包括聚酮类、生物碱类、核酸、脂类、苯丙素类、抗生素和萜类等。可见,碱胁迫时间越长,参与适应碱胁迫的代谢物种类越多,猴樟受到的影响也越大。植物体内维生素、类黄酮、木质素、生物碱、花青素等多种次生代谢