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1、 基于网络药理学和分子对接探讨癫痫宁片治疗癫痫的潜在作用机制研究 闫文浩，李晨豪，李尚颖，左莉华，李泽运*1.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 4500522.辽宁省药品检验检测院，辽宁 沈阳 110036癫痫是一种由于大脑神经元异常同步化放电引起的长期、慢性、反复、多病因、多临床表现的神经系统疾病1。其病因复杂，危害巨大，可造成不可逆的脑功能障碍甚至死亡。目前癫痫临床治疗主要包括化学药物治疗、中药治疗、生酮饮食、神经调控、外科手术治疗等，其中化学药物治疗依赖卡马西平、丙戊酸钠等抗癫痫药物，可能导致维生素D 水平降低、肝肾损伤等风险2。中医药治疗为癫痫控制提供了安全有效的补充手段3。癫痫宁片是
2、由石菖蒲、缬草、蜘蛛香、钩藤、甘松、薄荷脑、牵牛子、千金子组成，具芳香之气，行散之力较强，为宣气通窍之佳品，既能芳香化湿、醒脾健胃，又可化浊祛痰、涤痰开窍之药，具有化痰开窍、化湿和胃、醒神益智、理气活血、散风祛湿等功效4。近年来，癫痫宁片已被广泛应用于原发性、继发性癫痫治疗中，常与化学药物协同发挥作用，扬长避短，增强疗效5。然而，由于成分复杂，其作用机制至今仍不明确，有待进一步研究。随着系统生物学的发展，药物成分、靶点、通路的复杂多层次可被现代研究手段所识别展现，为中医药现代药理研究提供了强有力的工具。网络药理学与分子对接相结合的研究方法则逐渐系统化，广泛应用于中药复杂作用机制的探索6。网络药
3、理学通过公共数据库搜集或化学鉴别等手段，明确中药的化学物质基础、与疾病相对应的潜在靶点、可能形成的代谢通路等依次展开复方中药的多成分、多靶点、多通路生物学特征7；分子对接技术则对网络药理学研究揭示的核心靶点、核心成分进行亲和力评估，进而验证网络药理学研究的结果的准确性8。二者相结合产生了重要影响，成为中药复杂作用机制研究的系统策略。本研究以癫痫宁片为研究对象，基于网络药理学方法，初步探讨癫痫宁片治疗癫痫的作用机制，构建了药物的活性成分、靶点与癫痫相关疾病基因之间的相互作用网络，并进行分子生物学补充验证。本研究契合中医理论系统性、整体性的研究理念，为癫痫宁片治疗癫痫的临床合理应用和进一步科学研究
4、提供了理论依据。1 方法和方法1.1 癫痫宁片中药活性成分筛选、靶点预测通过TCMSP（ 中的“herb name”输入中药名称，以化合物口服生物利用度（OB）30%，类药性（DL）0.18 作为筛选条件，并且将无靶点的成分筛选掉。在TCMSP 数据库中，点击“related targets”获得各活性成分的靶蛋白名。利用Uniprot 数据库（https:/www.uniprot.org）的UniprotKB 检索功能将靶蛋白名转换为基因名，筛选条件为“organism：homo sapiens”。通过Herb 数据库（ 数据库（https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
5、）获得化合物其SMILES，导入到结构相似度预测靶点数据库 SwissTargetPrediction（http:/www.swisstarget prediction.ch）预测其有效靶点。1.2 癫痫相关靶点的获取通过在 GeneCards（https:/www.genecards.org/）、OMIM（https:/www.omim.org/）、DisGent（https:/www.disgenet.org/）数据库中输入Key“epilepsy”进行检索，以“relevance score”1 作为标准进行疾病相关的基因筛选，剔除重复基因，并经Uniprot 数据库进行校正。1.3 药
6、物疾病靶点预测结果将获得的药物作用靶点与癫痫靶点相互映射，然后作Venn 图，从而获得交集基因。然后使用Cytoscape 3.8.2 软件构建“药物活性成分靶点”网络，根据化合物与靶点的连接情况筛选出药物作用于癫痫的关键化合物。1.4 靶蛋白相互作用及核心靶点筛选为了进一步研究药物治疗癫痫的蛋白之间的相互作用，将药物交集基因上传至相互作用数据库String（https:/string-db.org/）进行蛋白相互作用（PPI）网络构建数据库；物种设置为“homo sapiens”，最低相互作用评分设置为0.9，其余参数保持默认设置，结果储存为TSV 格式，将TSV 文件导入Cytoscape
7、 3.8.2 中，并对网络进行分析，保存网络分析结果，使用Cytoscape 中的Generate style from statistics 工具，用节点大小和颜色反应反映degree的大小，节点越大degree 值越大；边的粗细用于反映combine score 的大小，边越粗combine score 越大，挑选核心的靶点做出PPI 网络图。1.5 基因本体论（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析将药物疾病交集基因上传至利用生物信息学开源软件Bioconductor（http:/www.bioconductor.org/）在R 语言内安装运行clusterProf
8、iler、Stringin、DOSE 和Pathview 程序，对其进行生物学过程的GO、KEGG 功能富集分析，并通过微生信平台进行可视化显示。利用微生信平台GO 基因功能从生物过程（BP）、细胞成分（CC）、分子功能（MF）3 个方面注释药物治疗癫痫的作用靶蛋白在基因功能中的作用。为阐明药物治疗癫痫的靶点在信号通路中进行KEGG 通路富集分析。选取GO 功能条目和KEGG 通路条目的前几位作为药物治疗癫痫的主要基因功能富集过程和信号通路，预测癫痫宁片治疗癫痫的潜在作用机制。1.6 分子对接将拓扑学参数排名靠前的大分子和小分子进行分子对接。蛋白质晶体结构由alphafold 数据（https
9、:/alphafold.ebi.ac.uk/）。对接小分子库由TCMSP 数据库（https:/old.tcmsp- Babel 及Autodock 程序对小分子库进行拆分等准备工作。对接使用Autodock 程序进行，最终结果导入pymol 进行对接结果的可视化。2 结果2.1 癫痫宁片活性成分筛选及靶点预测通过TCMSP 和Herb 数据库检索收集到钩藤20 个、石菖蒲6 个、千金子10 个、薄荷脑3 个、甘松5 个、牵牛子16 个、缬草20 个、蜘蛛香6 个有效成分；TCMSP 以OB30%、DL0.18 为条件筛选后，去除没有靶点的化合物后，最终共得到钩藤18 个、石菖蒲4 个、千金子
10、8 个、薄荷脑1 个、甘松4 个、牵牛子13 个、缬草18 个、蜘蛛香4 个化学成分和308 个有效靶点，见表1。表1 活性成分信息Table 1 Active ingredient information2.2 癫痫相关靶点通过在GeneCards（https:/www.genecards.org/）数据库中输入Key“epilepsy”进行检索，以“relevance score”1 作为标准进行筛选，共获得了2 317 条癫痫相关的靶点，从OMIM 数据库中共获得325 条关于癫痫相关靶点信息，在DisGent 数据库得到1 216 个靶点；合并3 个数据库的数据，剔除重复基因共得到2
11、837 个疾病靶点。2.3 药物活性成分靶点预测结果共获得癫痫宁片治疗癫痫的潜在作用靶点160个（图1）。将上述所得的活性成分和有效交集靶点数据导入到Cytoscape 3.8 进行网络构建，获得药物活性成分靶点网络，见图2。该网络共包含582个节点，1 831 条边。图中倒三角代表癫痫宁片所含中药，六边形节点代表中药成分，菱形节点代表靶点蛋白，其中黑线代表节点间的连接数量。对药物活性成分靶点网络进行分析，其中degree 前9 位的活性成分分别为毛钩藤碱（hirsutine）、山柰酚（kaempferol）、狼尾草麦角碱（penniclavin）、薄荷醇（menthol）、蒙花苷异戊酸酯（l
12、inarin isovalerate）、刺槐苷（acaciin）、广藿香烯（patchoulene）、-谷甾醇（-sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol），推测可能是复方的重要成分，见表2。采用CytoHubba 插件的degree 算法再次验证得到关键化合物，分别为毛钩藤碱、山柰酚、狼尾草麦角碱、-谷甾醇。图1 癫痫宁片化学成分靶点与癫痫疾病靶点Venn 图Fig.1 Venn diagram of chemical component targets of Dianxianning Tablets and epileptic disease targets图2 癫痫宁片药
13、物活性成分靶点网络图Fig.2 Dianxianning Tablets active ingredients-target network diagram表2 核心化学成分拓扑学参数Table 2 Topology parameter of key chemical components2.4 核心靶点及网络相互作用将药物成分靶点与癫痫相关的160 个共有靶点导入String（https:/string-db.org/）数据库中进行蛋白相互作用预测，物种设置为homo sapiens，为确保研究的可信度，置信度设置为0.9，其余参数默认设置；将网络文件保存为TSV 格式，将TSV 文件导入C
14、ytoscape 3.8.2 软件绘制PPI 网络，见图3。该网络共有82 个结点和252 条边。计算靶点相应属性信息，并以自由度（degree）、中介中心度（BC）、接近中心度（CC）、邻里连通性（NC）分别大于其相应中位数为筛选条件，进一步筛选核心靶点，最终得到癫痫宁片治疗癫痫的核心靶点共10 个，分别为V-Rel 网状内皮增生病毒癌基因同源物A（RELA）、转录因子AP-1（JUN）、有丝分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、信号传导和转录激活蛋白3（STAT3）、肿瘤蛋白p53（TP53）、蛋白激酶B1（Akt1）、雌激素受体（ESR1）、肿瘤坏死因子（TNF）、有丝分裂原活化蛋白激酶8
15、（MAPK8）。图3 核心靶点PPI 网络图（A）及核心靶点degree 值（B）Fig.3 Interaction network (A) and degrees of key targets (B)2.5 生物功能富集分析2.5.1GO 富集分析 取交集基因，利用R 软件进行GO 基因功能富集分析，共筛选出GO 条目5 195条，其中BP 相关的有4 314 条，CC 相关的334 条，MF 相关的547 条；以P0.05 作为标准筛选药物治疗疾病的显著富集的生物功能主要条目30 条，见图4。BP 主要涉及对药物的反应、活性氧代谢过程、对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应、对脂多糖的反应、对金属离子的响应、对细菌来源分子的反应、细胞对氧化应激的反应；CC 涉及膜筏、膜微区、膜区、质膜筏、小窝、突触前膜的组成部分、突触前膜的内在成分、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、突触后膜、囊泡腔等；MF 涉及碳酸盐脱水酶活性、药物结合、水解酶活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性
