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1、 基于单细胞水平的孕二烯酮诱导雌性西部食蚊鱼雄性化的研究 冯婷茵，邓希楷，邢 珂（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）【研究意义】动物的性别决定机制有两种类型，分别是遗传性别决定型（Genetic sex determination，GSD）和环境依赖性别决定型（Environment dependent sex determination，ESD）。高等脊椎动物，如哺乳动物和鸟类的性别决定机制属于遗传性别决定型1，而鱼类、两栖类和爬行类动物的性别决定机制不完全依赖于染色体，环境温度、pH 值、激素、行为模式等因素都会改变和影响个体的性别分化2-5，而且这种影响可以贯穿个体发育的全
2、过程。因此，在很多鱼类和爬行类动物中都可以观察到环境因素诱导的性别逆转现象。在水产养殖中，鱼类的个体大小、外形、体色等具有经济价值的性状通常与某一特定性别关联。如雄性罗非鱼（Oreochromis niloticus）和乌斑杂交鳢（Channa）都比其雌性个体生长速度快、体型大，具有更高的经济价值6-7；而大菱鲆（Scophthalmus maximus）雌鱼体型比雄鱼大50%8。西部食蚊鱼（Gambusia aff inis）为暖水性的小型硬骨鱼类，生活于水库、湖泊、坝塘、沼泽、稻田、水渠、洼地等各类静水水体中。因其嗜食蚊子幼虫及具有观赏价值而被引入我国，分布于长江以南诸多省区9。由于食蚊鱼
3、具有容易获得、生长速度快、繁殖能力强、性别二态性，且与哺乳动物对化学物质的反应方式相似等特点，近年来食蚊鱼被当成一种很好的模式生物，广泛应用于进化和生态等研究领域10-12。因此，利用食蚊鱼研究鱼类性别逆转，有助于在水产养殖业中控制种群性别比例、培养全单性种群，具有重要的科学意义和经济价值13-15。【前人研究进展】食蚊鱼的性别决定染色体为ZW/ZZ 型，但其性别分化同时受到环境因素的影响。研究发现，养猪场、纸浆造纸厂和城镇污水处理厂附近水域中高含量的孕激素使雌性食蚊鱼的性腺发育、生殖交配行为受到损害，并使其出现雄鱼的第二性征，进而改变该种群的雌雄比例16-17。深入研究表明由雌性食蚊鱼通过性
4、别逆转产生的伪雄性食蚊鱼具有与野生雄性食蚊鱼相似的追逐、摇摆、交配等行为18-19，但其摆动臀鳍的频率更低。此外，这些伪雄性食蚊鱼的生殖足无法与雌性个体完全匹配，需要在交配中保持更高的交配频率。以上研究表明，雌性食蚊鱼在环境中高剂量孕激素的诱导下可发生性别逆转现象，且其产生的伪雄性个体获得了部分生殖行为能力。【本研究切入点】虽然目前针对硬骨鱼类的性别逆转已有一些研究，但针对食蚊鱼的性别逆转研究鲜有报道，从单细胞基因表达水平探讨其性别逆转机制的研究仍为空白。本研究以养殖业中广泛应用的新型孕激素孕二烯酮（Gestodene，GES）作为外源激素20，以西部食蚊鱼(以下简称食蚊鱼）为研究对象，从形态
5、学和单细胞转录组水平研究孕二烯酮诱导下雌性食蚊鱼雄性化过程中性腺单细胞水平基因表达的变化。【拟解决的关键问题】本研究利用单细胞转录组测序技术，从单细胞水平分析孕二烯酮诱导后雌性食蚊鱼性腺基因表达谱的变化，挖掘雌性食蚊鱼雄性化的关键基因，初步解析食蚊鱼性别逆转的分子机理，丰富动物性腺单细胞数据，为后续研究提供更多有效的数据资源。1 材料与方法1.1 试验材料2022 年10 月于广州市花地湾花鸟鱼虫市场购买4 月龄左右的西部食蚊鱼，转至广州大学实验室水循环 养殖系统培养驯化，设置温度26(1)，光周期14 h10h（光照黑暗），水体硬度140(2.5) mg/L，水体导电性20(0.3)S/cm
6、，pH 值7.4(0.5)，溶解氧含量7.4(0.2)mg/L。经过2 个月驯化稳定后，食蚊鱼死亡率小于5%，已性成熟可用于试验。实验鱼的使用和实验操作符合“实验动物3R 原则”21。主要试剂包括孕二烯酮（GES,纯度99.4%）购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司（Sigma-Aldrich）、二甲基亚砜（DMSO,纯度99.9%）购自上海生工生物工程公司。500 ng/L 孕二烯酮溶液：将24 L 2 mg/mL 孕二烯酮溶液溶于4 776 L二甲基亚砜中，取1 250 L 加进25 L 水中。4 预冷的400 g/mL 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）溶液（含0.04% BSA,无Ca2+、M
7、g2+）；30预热的400 g/mL 1HBSS 缓冲液（含0.04%BSA，有Ca2+、Mg2+）；消化酶混合液：1 000 L 1 HBSS 缓冲液（30预热）+1 L DNA 酶（2 000 U/mL）+10 L 胶原酶（10%）+10 L胶原酶（10%）+10 L 胶原酶（10%）+5 L 透明质酸酶（10%）+10 L 中性蛋白酶（5%）+2 L 离子缓冲液。1.2 试验方法1.2.1试验分组与处理 挑选 体长为3.0（0.5）cm、体质量为130（50）mg 的成年雌性食蚊鱼（6 月龄）和体长为1.9（0.6）cm、体质量为110（70）mg 的成年雄性食蚊鱼（6 月龄）参与孕二烯
8、酮暴露实验。设置雄性和雌性食蚊鱼的空白对照（FC，female control；MC，male control）以及雌性食蚊鱼孕二烯酮暴露4 周和8周的处理组（F4，female treated for 4 weeks；F8，female treated for 8 weeks），各组设3 个重复。孕二烯酮处理组为每个容积12 L 的缸中放置10 条雌性成鱼和10 L 孕二烯酮暴露溶液。1.2.2单细胞悬液制备 用解剖剪刀由食蚊鱼肛门开始沿腹部剪至鳃盖下缘，再从两端分别向背部解剖，在体视镜下取出性腺组织，使用 预冷至4 的1PBS 洗涤 23 次。将组织切成小碎片，然后转移到消化酶混合液中，3
9、0 消化3050 min，每隔3 min 摇1 次，进行初步显微镜检查。消化后的细胞悬液用70 m 过滤器过滤，用2 mL 1 PBS 清洗离心管和细胞筛。用水平离心机在4 下以200 g 离心5 min；取上清，加入5 mL 1PBS 重悬细胞，再以200 g 离心5 min，洗涤23 次；根据沉淀的量加入预冷的1PBS 溶液（沉淀较大加入1 mL，较少则加入0.5 mL，几乎看不到沉淀则加100 L），轻轻混匀。利用显微镜细胞计数板和0.2%台盼蓝染色液检测细胞浓度和活性并记录。1.2.3单细胞文库构建及测序 使用10GenomicsTM微流控芯片，将单细胞悬液和Chromium Sing
10、le Cell 3 Reagent（v3，10Genomics）试剂盒混合，在油相反应体系中形成单细胞珠状凝胶液滴22。随后，在53 下反转录45 min、85 下反应5 min 后终止反应，制备出测序所需的cDNA。将cDNA 进行PCR 扩增，对得到的扩增cDNA 进行片段化、末端修复和补全polyA 尾巴，添加测序接头并进行文库扩增，最终制备出单细胞cDNA文库。单细胞测序采用10Genomics Novaseq 6000 测序平台，并用CellRanger（10GenomicsTM）比对得到原始测序数据。1.3 数据处理及分析使用Seurat23进行主成分分析（Principle Co
11、mponent Analysis，PCA），选择适当的主成分进行下一步非监督聚类和UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）分析。根据单细胞聚类结果，在Seurat 中进行特征基因筛选，确定每个细胞亚群的特征基因，并利用CellKB24和Fish Enrichr25-26数据库鉴定每个细胞亚群对应的细胞类型。根据细胞类型注释的结果，选择相关的细胞群进行细胞轨迹分析。使用Monocle27将单细胞数据集转换成CDS（Cell dataset object）类型，进行预处理（使用降维函数将数据缩小到较低维 度，reduction_meth
12、od=“UMAP”，preprocess_method=“Aligned”），嵌入降维数据，进行拟时序计算。在过滤掉低质量数据后进行细胞聚类分析，根据不同的细胞状态分类并进行可视化分析。根据上述拟时序计算和细胞分化轨迹结果，找到关键细胞群的分化节点，通过BEAM（Branch Expression Analysis Modeling）分析筛选对分化节点最关键的基因28-29，并使用cluster Profiler30进行KEGG 富集分析。2 结果与分析2.1 孕二烯酮诱导后的食蚊鱼鳍部形态变化孕二烯酮诱导后的雌性食蚊鱼臀鳍形态发生了雄性化的变化。野生雌性食蚊鱼的臀鳍为扇形或三角形，而雄性的臀
13、鳍具有特化的生殖足结构。经孕二烯酮诱导处理48 周后，雌性食蚊鱼臀鳍发生了不同程度的特化现象，呈现出类似于雄性生殖足的结构（图1）。结果表明，孕二烯酮在雌性食蚊鱼的性别逆转过程中起重要的调节作用，能够促进其雄性化外部特征的出现。图1 孕二烯酮诱导后的食蚊鱼鳍部形态变化Fig.1 Changes in fin morphology of mosquitofish exposed to GES2.2 孕二烯酮诱导后的食蚊鱼性腺细胞构成变化为进一步探究孕二烯酮诱导下雌性食蚊鱼雄性化的分子机制，本研究分别收集MC、FC、F4和F8 组的食蚊鱼性腺进行单细胞测序。测序产生的数据使用CellRanger
14、软件进行单细胞基因表达定量分析；将表达数据进行质量控制和筛选，剔除低质量单细胞数据，最终获得每个样本的单细胞基因表达谱。MC、FC、F4 和F8 样本的测序数据如表1 所示，单个样本有效细胞数介于8 98213 873 之间，检测到的有效表达基因数目介于19 89120 250 之间，有效Barcodes 比例均在97%以上，表明数据质量优秀。表1 食蚊鱼性腺单细胞测序数据概况Table 1 Overview of single-cell sequencing data on gonads of mosquitofish分析使用Sctransform 对4 个样本的数据进行归一化并整合，利用U
15、MAP 进行降维处理。由图2B 可见，野生雌性FC 组和孕二烯酮处理后的雌性F4、F8 组细胞重叠较好，而雄性MC 组的细胞相对呈独立分布特征，说明成年雌性食蚊鱼和雄性食蚊鱼性腺细胞构成具有较大差异，且经孕二烯酮诱导后的雌性性腺细胞构成仍与雄性不同。图2 食蚊鱼性腺单细胞UMAP 图谱Fig.2 Single-cell UMAP diagrams of gonads in mosquitofish为了确定食蚊鱼性腺的具体细胞构成类型和对应的基因表达情况，本研究进一步对细胞进行聚类，提取每个细胞类群特异高表达的marker 基因，利用CellKB 和Fish Enrichr 对细胞类型进行注释分
16、析。剔除血液细胞和免疫细胞后，结果发现食蚊鱼性腺一共包含6 种主要的细胞类型（图2A，表2）。不同样本间比较发现，雄性食蚊鱼性腺主要由成纤维细胞、雄性生殖细胞、上皮细胞和原始生殖细胞构成，而雌性性腺主要由内皮细胞、成纤维细胞、卵母细胞和原始生殖细胞构成。孕二烯酮诱导处理48 周后，雌性食蚊鱼性腺中产生少量的雄性生殖细胞（F4 0.79%，F8 0.39%）。此外，诱导8 周后性腺中原始生殖细胞比例较野生雌性样本极显著上升。表2 食蚊鱼性腺单细胞细胞类型比例Table 2 Proportion of cell types in gonads of mosquitofish (%)2.3 原始生殖细胞的基因表达与分化2.3.1原
