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1、 欧亚类禽H1N1猪流感病毒抗原性变异关键氨基酸的鉴定与分析 张乃心，许程志，杨玉莹，张亚萍，万云飞，乔传玲，陈化兰欧亚类禽H1N1猪流感病毒抗原性变异关键氨基酸的鉴定与分析张乃心，许程志，杨玉莹，张亚萍，万云飞，乔传玲，陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室，哈尔滨 150069【背景】流感病毒的抗原性主要是由病毒的表面糖蛋白HA决定的，前期利用欧亚类禽型H1N1猪流感病毒（EA H1N1 SIV）HA蛋白单克隆抗体（mAb）筛选抗原逃逸株发现，HA蛋白190、230和269位（H3编码）氨基酸的改变能够导致病毒发生抗原逃逸，并发现在新近分离的EA H1N1 SIV
2、 HA蛋白广泛存在这3个氨基酸的变异。【目的】进一步探索哪些氨基酸对病毒的抗原性具有关键作用，为流感的防控提供科学依据。【方法】选取一株病毒A/swine/Liaoning/SY72/2018（H1N1） SY72为模式病毒，建立该病毒的反向遗传系统（RGS），又以SY72为骨架，拯救含有HA基因190、230和269单点突变重组病毒；利用rSY72病毒制备灭活疫苗，分别免疫SPF鸡和非免疫猪制备其相应的血清，通过中和试验和血凝抑制（HI）试验分析病毒的抗原性，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点；继而评估HA蛋白不同位点氨基酸的改变对病毒复制特性及受体结合特性等的影响。【结果】分析SY72病毒
3、的HA氨基酸序列发现，该病毒HA蛋白分别含有190D、230M和269R。利用反向遗传技术，分别拯救了病毒rSY72及单点突变病毒rSY72HA/D190N、rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M；中和试验结果表明，与rSY72相比较，3株突变病毒均能够与两株mAbs发生一定反应；HI试验结果显示，与rSY72相比较，突变病毒rSY72HA/D190N与rSY72免疫鸡血清和猪血清的反应减弱，HI抗体效价分别出现了4倍和8倍的差异，而病毒rSY72HA/M230I和rSY72HA/R269M与两种血清的反应差异不明显，表明HA蛋白190位氨基酸改变对病毒的抗原性影响最为明显；病
4、毒蚀斑测定及复制动力学研究结果发现D190N 的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/D190N在MDCK细胞上形成的蚀斑减小，而R269M的氨基酸替换导致病毒rSY72HA/R269M在MDCK细胞上的复制能力下降；3个位点的氨基酸替换均未影响病毒的受体结合特性。【结论】HA蛋白190位氨基酸对EA H1N1 SIV抗原性具有决定作用，269位氨基酸突变使得病毒在MDCK细胞上的复制能力降低。这提示在后续开展的病原学监测中要密切关注这些氨基酸的变异情况，提高对动物流感的预警预报。猪流感病毒；HA蛋白；抗原性0 引言【研究意义】猪作为A型流感病毒感染的重要宿主，一直以来在流感病毒的进化及新型流感病
5、毒的产生过程中扮演着重要角色1-2。近年来开展的猪流感（swine influenza，SI）监测结果表明欧亚类禽型H1N1 （Eurasian avian-like H1N1，EA H1N1）猪流感病毒（swine influenza virus，SIV）在猪群中广泛流行，而且出现了对人的零星感染3-9。尤其是2009 /H1N1流感病毒出现以后，它作为流感病毒内部基因的供体，持续地与猪群中早先流行的H1N1、H3N2及H1N2 流感病毒发生新的重组8,10。同时，已有研究发现新型重组EA H1N1 SIV存在抗原漂移的现象。这些不断出现的新毒株给疫苗研制及疫情防控带来了新挑战11-13。因
6、此，开展流感病毒抗原变异分析，探索其分子基础，将为EA H1N1 SIV的风险评估和有效防控提供重要的科学依据。【前人研究进展】流感病毒依赖于其持续的抗原性变异不断突破宿主界限和逃避宿主的免疫保护，抗原漂移和抗原转变是流感病毒抗原性变异的两种主要方式14-16。流感病毒的各个基因中发生持续性变异的是血凝素（hemagglutinin，HA）基因，其次为神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因17。前期研究结果发现HA 158位氨基酸的改变能够显著影响EA H1N1 SIV的抗原性18。笔者所在实验室前期利用EA H1N1 SIV A/swine/Henan/11/2005（简称HeN
7、11）HA蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）筛选了两株抗原逃逸株，HeN11-2B6-P5逃逸株在190和230位同时发生氨基酸改变，HeN11-4C7-P8逃逸株在269位发生氨基酸改变。通过对SIV HA 基因系统的序列分析也发现新近分离的EA H1N1 SIV毒株大多数携带HA 190D、230M和269R13,19。【本研究切入点】本研究拟借助反向遗传系统（reverse genetics system，RGS）构建单点突变病毒，并制备相关病毒的免疫血清，利用HI试验测定病毒的抗原性，进一步分析决定病毒抗原性变异的关键氨基酸位点，同时测定HA蛋白相关突变位
8、点对病毒生物学特性的影响。【拟解决的关键问题】明确近年来导致我国H1N1 SIV抗原漂移的重要氨基酸突变，确定影响病毒抗原性的关键氨基酸位点。研究结果将有助于加深对流感病毒抗原性变异规律的了解，为流感病毒的监测与防控提供重要依据和参考。1 材料与方法试验于2021年5月至2022年7月在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室完成。1.1 病毒、抗体、质粒、细胞和实验动物一株H1N1亚型SIV A/swine/Liaoning/ SY72/2018（简称SY72）为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室分离、鉴定并保存；两株HeN11 HA蛋白的mAbs（2B
9、6和4C7）为该试验室制备和保存19；双向表达质粒pHW2000由美国St. Jude儿童医院Richard Webby教授惠赠；MDCK细胞和293T细胞均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室保存；911日龄无特定病原体（specific pathogen-free，SPF）鸡胚及8周龄SPF鸡均购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心，6周龄非免疫猪（经HI试验检测H1和H3亚型SIV抗体阴性）购自哈尔滨市郊农场。1.2 试剂和试剂盒TIANamp病毒RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生物公司，反转录试剂盒购自Invitrogen 公司；PrimeSTAR Max DN
10、A 聚合酶购自大连宝生物公司；限制性内切酶BsmB购自NEB公司；同源重组试剂盒Clon Express II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物公司；Gene color II非EB荧光染料购自北京金博益生物公司；胶回收试剂盒购自OMEGA公司；DNA测序试剂购自Applied Biosystems公司；转染试剂盒LipofectamineTMLTX and Plus Reagent购自Invitrogen公司；培养基Opti-MEM、DMEM购自 Gibco 公司；受体实验一抗为SY72病毒的鸡血清，二抗兔抗鸡IgG-HRP 购自Sigma-Aldrich公司；受体
11、破坏酶（receptor destroying enzyme，RDE）购自日本生物科技株式会社。1.3 病毒拯救1.3.1 引物设计 依据毒株 SY72序列及文献20分别设计PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M 和 NS 8个基因片段的上、下游扩增引物（引物序列略）。反转录引物为 Uni-12 ：5-AGCRAAAGCAGG-3，均由吉林库美生物科技有限公司合成。1.3.2 病毒SY72反向遗传系统的建立 重组质粒的构建按照文献21-22的方法进行，获得重组质粒后通过测序进行鉴定。依据LipofectamineTMLTX and Plus Reagent说明书进行转染，将8个重组质粒各取
12、250 ng共转染于混合培养的293T细胞和MDCK细胞。转染48 h后，收取细胞培养物经尿囊腔接种于SPF鸡胚增殖病毒。对救获病毒进行全基因组序列测定，与野生型病毒基因序列分别进行比对，确定拯救病毒与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。1.3.3 SY72单点突变病毒的拯救 针对190、230和269等3个差异位点设计相应的点突变引物（表1），以质粒pHW-SY72 HA为模版，通过PCR分别构建含有HA基因190、230和269等3个单点突变的质粒。将制备的HA突变质粒与病毒其他7个基因的重组质粒各取250 ng共转染于混合培养的293T和MDCK细胞。转染48 h后，收取细胞培养物经尿囊腔接种
13、于SPF鸡胚增殖病毒。对救获病毒进行全基因组序列测定，与野生型病毒基因序列分别进行比对，确保所拯救病毒仅HA基因含有目标位点的突变，其他基因片段无突变。将病毒分装、保存于-80，用于后续试验。表1 差异位点的点突变引物1.4 免疫血清的制备分别将拯救的重组病毒接种10日龄SPF 鸡胚，收获尿囊液，-丙内酯灭活，佐剂乳化后制备灭活疫苗，接种8周龄SPF鸡，0.3 mL/只，免疫后3周，采血分离血清，用于HI试验，与此同时，将制备的灭活疫苗接种于非免疫猪，2 mL/头，免疫后2周采血分离血清，血清经RDE处理后用于HI检测。1.5 病毒的复制特性测定将1.3.3中所述各病毒分别以感染复数（mult
14、iplicity of infection，MOI）为0.001的病毒量接种于85%铺满的MDCK细胞板，37孵育1 h后，更换为含有1 gmL-1的TPCK-胰酶的DMEM培养基，并于感染后12、24、36和48 h收集上清，将所获上清于-80保存备用。待所有样品收集完成后，在MDCK细胞中用终点滴定法测定病毒滴度，以平均log10TCID50/mL标准差表示。1.6 蚀斑测定分别将拯救的重组病毒进行10倍倍比稀释后接种于85%铺满的MDCK细胞板，37 孵育1 h后，弃去病毒液，将2MEM（0.6% BSA, 1 gmL-1TPCK-胰酶）与2%低熔点琼脂糖等体积混合后加入细胞孔中，室温放
15、置20 min待琼脂糖完全凝固后，倒置于细胞培养箱中培养72 h，用福尔马林固定细胞，0.1%结晶紫染色观察并计数斑块。1.7 病毒受体结合特性的测定1.7.1 病毒蛋白纯化 将1.4中所述增殖灭活后的尿囊液进行蔗糖密度梯度离心。首先8 000 r/min、4 高速离心30 min后取上清。其次将上清30 000 r/min、4 超速离心2 h后弃上清取沉淀并用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）溶解。在超速离心管中分别加入20%、40%、60%蔗糖，将上述病毒液缓慢置于顶层。 28 000 r/min、4 超速离心2 h后取40%60%浓度梯度之间的白
16、色絮状物。最后加入适量PBS进行脱糖，30 000 r/min 、4 超速离心2 h后弃上清取沉淀，将病毒用适量PBS重新悬浮后测定病毒浓度及效价。1.7.2 病毒受体结合特性检测 将SA -2，3 Gal和SA -2，6 Gal两种糖链使用PBS稀释至100 ng，倍比稀释至第10孔包被于96孔板中，置于紫外下交联10 min；弃上清，用300 L冰上预冷的PBS洗涤4遍。用含0.5% BSA的0.05% PBST（PBS中含0.05% Tween 20）稀释纯化的病毒至HA效价为6 HAU，每孔加入100 L，4包被过夜，弃上清，用冰上预冷的0.5% PBST清洗3遍，再用冰上预冷的PBS清洗1遍。加入4%多聚甲醛灭活NA，之后用PBST 清洗3遍，PBS清洗1遍。按照1600的比例稀释抗rSY72的鸡血清作为一抗，每孔100 L，37
