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1、分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2021年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。2、学习和掌握质粒、T载体的特点。3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。4、学习和掌握Xcm I酶切制备T载体的过程及方法。5、学习和掌握CaC 12法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。二、相关知识一T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物T-
2、A Cloning的商业化专用载体，由pMC 18载体改建 而成。在pMC 18多克隆位点处的X矗I和Sall识别位点之间插入了 EcoRN识别位点，用EcoRN进行 酶切反响后，再左两侧的3,端添加“T而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。相关知识点：1质粒的提取；2酶切；3PCR等。二DNA的重组与连接PCR产物的克隆把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒， 这个过程称为亚克隆。所谓重组，就是把外源目的基因“装进载体的过程，即DNA的重新组合。为了 将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法
3、将载 体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配 伍末端compatible end，以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用 载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。相关知识点：1克隆与亚克隆；2DNA重组；3内切酶；4粘性末端与平末端；5连接 酶；6连接酶的分类及功能等。三大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大 量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞，大肠杆菌 宿主菌是目前基因工程最
4、常用的受体细胞。感受态细胞competent cell是经过一定方法处理后，具有 接受外源DNA能力的大肠杆菌，只有开展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。相关知识点：1克隆；2宿主细胞的定义及分类；3感受态细胞定义及其功能；4转化定 义及方法DMSO、MnCl2、TB aq、PEG等。四重组DNA的转化及重组子的鉴定将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两 个目的，一是大量产生重组DNA分子，在完成连接反响后，重组DNA分子往往只有纳克级的量，不易 操作和进行下一步的分析，假设把重组DNA分子导入到细菌细胞中，细菌细胞可分裂屡次产生克
5、隆，克 隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子，这样重组DNA分子的量就多了；二是对重组DNA 分子进行纯化，在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子，连接过程完成 以后体系中有多种分子存在，除了需要的重组DNA分子以外，还含有没有连接上的载体分子、没有连接 上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子，未连接上的载体和 DNA片段对实验影响不大，因为它们即使导入细菌细胞，因为不能复制，很快就要被细菌细胞中的酶降 解掉；对克隆工作带来影响的是后两种分子，因为它们都为环状，在细菌细胞中都能复制，因而都能产 生克隆，但是每个细胞中只能导
6、入一个质粒DNA分子，每个单克隆都是由一个细胞形成的，因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选，就可以鉴定所需的重组DNA 分子。所谓的重组子recombinant也叫做转化子transformant是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片 段别离出来，并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因，这过程称为筛选screening。根据载体体 系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同，初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛 选，直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选
7、择性载体筛选法、分子杂交选择法；间接筛选也可 以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法；本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。相关知识点:1导入的方法，转化transformation转染(transinjection) 显影注射 基因枪质粒plasmid 噬菌体phagegeneblaster 脂质体介导法 其它方法：快速冷冻法、碳化硅纤维介导法2重组子： 转化子 3重组反响体系中的成分：4筛选的方法,DNA鉴定筛选法：定位、测序 直接筛选法I选择性载体筛选法：入ph包裹、抗药性a-互补分子杂交筛选法：ISH、Southern Blot免疫化学 间接筛选法 J酶免疫检测mRNA翻译检测法五质
8、粒DNA的提取碱裂解法原核生物没有真正的细胞核，DNA 一般位于一个类似“核的结构称为类核体上因为不是一 个完整的细胞核。的遗传物质主要是染色体DNA，的染色体为双股环状DNA，含有1 400个以上的基 因，另外还有一些质粒DNA。1、质粒的概念质粒是细菌如染色体外的小型环状双链DNA分子。一般说来，质粒不是细菌生长繁殖所必须的 结构，就细胞生存而言，质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构，故能在细菌内独 立地进行复制，并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。2、研究质粒的意义1质粒作为一种裸露的，比病毒更简单、更有自主复制能力的DNA分子，正好处于生命与非生 命的分水岭上。由于质粒
9、能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息，说明质粒是独立的有机体，是亚 细胞生命体系的成员，是比病毒更简单的原始生命形态，所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。2要把一个有用的基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。携带外源基因进入受 体细胞的这种工具叫载体。由于质粒具有遗传传递和遗传交换的能力，因此，质粒作为基因工程的重要 运载工具，在现代分子生物学占有重要地位。3、质粒的分类不同的质粒在宿主细胞中的拷数也不同，根据质粒在细胞中拷贝数的多少，Rownd1969把质粒分 为严密型质粒和松弛型质粒。1严密型质粒stringent plasmid：严密型质粒多半是一些具有自身传递能力的大
10、质粒，其DNA 的复制与宿主染色体DNA的复制相偶联，受到某种程度的控制，每个细胞仅有1-2个拷贝。2松驰型质粒relaxed plasmid：松驰型质粒多半是分子量较小、不具传递能力的质粒，其复制 是在松驰控制下进行的，每个细胞的拷贝数约为10200个。当向培养基中参加氯霉素时，细胞的蛋白 质合成被抑制，细胞染色体DNA和严密型质粒DNA的复制停止，松驰型质粒DNA的复制继续进行。 松驰型质粒DNA的拷贝数可达数百个，基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒。相关知识点：1质粒的分类： 与宿主相关程度：严密型质粒stringent plasmid、松弛型质粒relaxed 是否有转移基因：接合型质
11、粒、非接合型质粒 带有特殊用途的基因：生殖质粒F质粒、抗性质粒R-质粒、col质粒编码杀死其他细菌的 蛋白质、降解质粒、致病质粒Ti2质粒的提取方法：煮沸法、CsCl、试剂盒、碱裂解法；3质粒的构型： SC 构型：cccDNA (covalently closed circle DNA) OC 构型：ocDNA (open circle DNA) L 构型：L-DNA (linearDNA)三、实验原理一T载体的制备5，t3T-vectorc G53TA.AT:G C . .ATGCGCATATTATX TATtTAATCGTAGCCGTACGrGC.Xcm I是一种m型的限制性核酸内切酶，其
12、识别序列为：5r-CCANNNNNANNNNTGG-3r3r-GGTNNNNANNNNNACC-5其中阴影局部为Xcm I的识别序列，5”为Xcm I的切割位点，其识别序列中间的9个任意核苷酸N 对Xcm I的酶切特异性及酶切效率没有影响。为了能得到用Xcm I酶切后3,末端均是T的载体，本实验利 用了乂”1的识别序列的特点，引物的3,端带WXcm I酶切位点，其序列如下：Primerl： 5-CGCCCATGCTAAGCGCTGGTAAT 3，Primer2： 3- TCTCTAAGGTATGCaaTATGACCCGG 5，引物中”为Xcm I的切割位点，当Xcm I对PCR得到的线性片段进
13、行酶切的时候，便会产生一个与 T载体形式完全一样的3-T粘性末端。二DNA的重组与连接PCR产物的克隆1988年，Clarke发现所有的PCR产物都在Taq DNA聚合酶的作用下在3端附加上了一个3突出的 腺苷酸，因为Taq DNA聚合酶具有非模板介导的核苷酸转移酶活性，可在双链DNA末端加上一个单一 的3,突出的dATP，利用Taq DNA聚合酶的这一特性，在克隆载体上附加3胸腺嘧啶dTTP形成T-A 克隆系统，即可直接对PCR产物进行有效的克隆，这样的载体称为T-载体。三大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备技术是从20世纪70年代初期开展起来的，当时人们发现如果把E.coli
14、细胞浸在一冰冷的盐溶液，它吸收DNA分子的能力要比不浸的细胞强；经过摸索和总结，人们终于采用 50 mmol/L的氯化钙CaCl2溶液来制备感受态细胞。其他的盐如氯化铷RbCl也很有效。尽管对这 一处理确实切机制仍不清楚，但有人对感受态提出了两种假说，一种认为是细菌细胞壁的局部失去了壁 结构或局部溶解，让外源DNA分子通过质膜进入；另一种认为DNA分子能进入细菌细胞是由于细胞处 于感受态时外表形成了一种可接受DNA的酶位点。一旦细胞被处理制备成感受态细胞，它们就能稳定地 摄取外源DNA分子了。四重组DNA的转化及重组子的鉴定转化是使重组体DNA分子在热休克的短暂时间内被导入受体。一般认为DNA
15、分子在转化过程中将 经历四个阶段，第一个阶段是吸附阶段，完整的双链DNA分子将吸附于感受态细胞的外表；第二个阶段 为转入阶段，双链DNA分子解链，以单链的形式进入细胞，而另一链那么被降解；第三阶段是自身稳定 阶段，外源质粒在细胞内又复制成双链环状DNA ；第四个阶段是表达阶段，即目的基因随同质粒的复制 子一起复制。有些株系的尽管用抗生素抗性基因的插入失活法来筛选重组子很方便，但有的质粒还是采用了其他 基因进行筛选，效果同样不错。以pMC 8载体为例，它除了含有氨苄青霉抗性基因以外，还含有一个称 为LacZ，的基因。该基因编码0-半乳糖苷酶的一局部。半乳糖苷酶参与的将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的 生化过程，本来是由染色体上的LacZ基因编码。有些株系的带有修饰过的LacZ基因即缺少LacZ，的 LacZ基因，只编码0-半乳糖苷酶的a-肽
