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1、叶酸介导的大分子抗癌治疗药物的传递摘要：叶酸受体是肿瘤特异性药物传递的有效靶点，主要原因是：（1）它可以 调节许多人类癌细胞，包括卵巢、脑、肾、乳腺、髓细胞和肺的恶性肿瘤细胞，（2）在正常组织中被叶酸受体识别，由于其在极化上皮细胞的顶端（外面）膜 的位置，可以严重限制其在正常组织中的表达，（3）叶酸受体密度随着癌症恶 化的阶段/分级增加。因此，最难用经典方法治疗的癌症可能在叶酸靶向治疗中 是最容易的。利用这些叶酸受体表达的特点，叶酸已被链接到两个低分子量和高 分子配合物上，用于靶向分子靶向恶性细胞的研究。叶酸与大分子的结合，在体 外几乎所有的情况下都能增强其对叶酸受体表达癌细胞的传递作用。然而
2、，叶酸 介导的分子靶向在体内只产生了混合的结果，很大程度上是因为实体肿瘤分子的 渗透问题。尽管如此，叶酸靶向性显著改善了一种以高分子为基础的治疗的例子 也确实存在，这导致在许多情况下，完全治愈了确定的肿瘤细胞。这篇综述讲述 了一个简短的叶酸靶向大分子疗法的机械背景，然后总结了各大技术在应用中的 优缺点。1介绍蛋白质、基因治疗载体、脂质体包裹药物、核酸适配体、反义寡核苷酸、药物衍 生的生物降解的聚合物对癌症治疗都显示极大的潜力，主要是因为其特异性的改 进、作用时间的延长、或更传统的化疗药物效力的增强。然而，不同于低分子量 的药物，大分子药物往往会遇到显着的渗透性障碍，从而限制上述理想的性能的 实
3、现。因此，尽管肿瘤的选择性往往是由于肿瘤的高度差形成的血管和随之而来 的被动积累的大分子在恶性肿块称为增强渗透和滞留（EPR ）效应，但肿瘤细 胞膜仍然可以构成一个强大的屏障，这些大分子必须进入他们的靶细胞，从而导 致细胞死亡。如果肿瘤淋巴管引流不发达，瘤内压力的增加也可以限制大分子药 物在肿瘤部位深部的药物传递。为了克服这些限制，许多人采用已经采用癌细胞 特异性配体作为靶向部分，在肿瘤组织提高大分子传递和治疗。这篇综述的目的 是总结在开发维生素、叶酸作为配体的选择性靶向和交付的大分子药物进入肿瘤 细胞的进展。在几种代谢途径中，叶酸是一种碳转移反应所需的维生素，因为叶酸在核苷 酸的生物合成中是
4、必不可少的，在增殖细胞中消耗大量的维生素。正常细胞跨膜 运输的生理叶酸使用两种膜相关的蛋白质:还原叶酸载体或叶酸受体（FR）。研 究发现前者在几乎所有细胞中负责生理叶酸摄取的主要途径。后者主要出现在极化上皮细胞和活化的巨噬细胞中，并且优先结合和内化通过氧化叶酸受体介导的 内吞作用。虽然低浓度的还原叶酸载体可能足以供应大部分正常细胞的叶酸需 求，但FR经常在肿瘤细胞中高表达，当供应有限时，使恶性细胞成功地争夺维 生素。尽管FR在许多癌细胞中的过度表达可以很明显地识别受体的一个潜在靶点 和抗体介导的癌症的治疗，但FR也可以进一步作为一个合格的肿瘤特异性的靶 点，因为它通常只有在恶性转化后，静脉注射
5、才有用。那是因为FR选择性地表 达在某些上皮细胞顶膜的表面（即，膜面体腔），它对血生试剂来说不可用，因 此，阻碍了 FR-介导的治疗药物在等离子体中的传递。然而，在上皮细胞转化时， 细胞极性丧失，FR成为靶向药物进入循环。这可能是因为这种双重机制的肿瘤 特异性，受体的天然配体、叶酸已成为一种靶向附着药物传递到癌细胞中的有效 分子。叶酸已经因其高亲和力、（KD10T0M），免疫原性低、易修改、体积 小（分子量：441.4），在储存过程中稳定性好、兼容多种有机和水性溶剂、成 本低、随时可用等优点，吸引力越来越强。到目前为止，许多化学和生物治疗药 物已成功与叶酸连接，其中大部分在体内和体外都表现出显
6、着增强了 FR-阳性肿 瘤细胞的传递。在下面的叶酸靶向高分子抗癌药物的总结中，我们不仅讲述大分 子靶向识别领域中的成功事例，而且指出了只有超越之前的各种靶向叶酸的应用 才可以充分发挥其潜力所存在的缺陷。2基本知识21叶酸受体的结构与功能人类FR家族（Mr38 kDa）包括其三个特征的亚型（FR-a、FR-卩和YY），他们 的氨基酸序列70-80%相同，但表达模式不同。FR-a和FR-卩由于其附着的糖基 磷脂酰肌醇（GPI）膜锚，都是膜相关蛋白。然而，FR-a区别于FR-P的是其对 循环叶酸辅酶、（6S）-5-甲基四氢叶酸（5-CH3H4叶酸）具有高亲和力、也可通过 减少叶酸辅酶的相对定向来区分
7、。FR-a也可以高亲和力（KD0.1 nm）与叶酸 和生理叶酸结合，亲和力明显高于FR-P（KD1 nm）FR -丫和截短形式的蛋白 FR -/缺乏GPI锚，并且在人类FR可溶性形式中几乎检测不到组成型分泌的数 量。分泌的FR -Y与叶酸的结合亲和力据报道是0.4 nm。最近，一个基因编码 了一种可能的受体的第四亚型基因（FR -8），并且在人类基因组的未知区域被 鉴定。然而，FR -8无论在成人还是胎儿组织中的表达分析表明，并没有可检测 的蛋白质水平，这说明有一种可能性的瞬时表达模式，剪接变体或FR假基因。22在正常和恶性细胞中叶酸受体的表达各亚型的表达（a,卩，y/Y）都具有组织特异性和分
8、化依赖性。随着一些正常组 织的异常（肾，胎盘，和脉络丛），FR -a在正常上皮细胞中以低水平存在，但 在上皮来源的恶性肿瘤组织中却大大提升，尤其是卵巢、子宫、子宫内膜、脑、 肾、头部和颈部、间皮中。3H-叶酸与粗膜制剂结合后测定（图1）,在相同来 源的正常和恶性组织中的FR-a的表达差异是相当惊人的，上调水平的差距接近 两个数量级。在诊断为上皮性卵巢癌患者中，FR-a过表达的程度与较高的组织 学分级和更高级的癌细胞阶段相关，这表明快速生长的肿瘤细胞可能需要高的叶 酸量。另外一个关于FR表达和抵抗程度之间的标准化疗方案也有报道。那就是, 幸存于标准化学疗法的肿瘤细胞通常具有更高的FR水平。可以想
9、象，更高阶段、 更高级别、和化疗耐药性的癌症，即标准程序最难治疗的肿瘤，就包括最容易被 叶酸相关药物靶向的癌症。FR -卩，最初在大鼠胎盘中发现，构成型FR最常用的表达在造血细胞和非上 皮细胞，如脾脏和胸腺。FR -卩也在一些非上皮源性的恶性肿瘤中浓度上升，包 括髓细胞性白血病和肉瘤。重要的是，虽然FR -卩可以在造血干/祖细胞和髓系细 胞分化的细胞中检测到，但是它在这些细胞中是没有活性的，即，一种与叶酸没 有亲和力的形态。事实上，一个功能性的FR -卩到目前只能在有活性的（但不是 休眠的）巨噬细胞中检测到。FR -Y和Y也被认为是与造血组织有特异性，特别 是淋巴细胞，并只在非常低的水平表示达
10、。分泌形式的FR可作为某些造血系统 恶性肿瘤的潜在血清标志物。因为相对高水平的FR可以在肾近端小管和脑脉络丛中测量，所以会出现的问题 就是靶向FR治疗药物可能对这两种组织产生毒性。然而，如上所述，免疫组织 化学技术和121叶酸放射自显影展现了这些正常上皮细胞中FR分布的高度极化 模式。例如，在近端小管中，FR仅在顶端/腔或尿面对肾小管细胞的表面上可以 观察到，这里可能有助于尿中叶酸的重吸收。因此，叶酸靶向大分子应该只有在 个人患有蛋白尿或者其他肾功能障碍时才能遇到肾FR。同样地，FRS在大脑似 乎集中在大脑边缘的血脑屏障，在那里他们的功能是保留的维生素在脑脊液中， 正如预期的那样，通过免疫组化
11、染色的FR弥漫在整个肿瘤细胞表面，从而使恶 性脉络丛肿瘤细胞失去偏振分布模式。基于这些及相关的观察，目前还没有证据 表明FR表达水平升高会损伤正常组织。2.3通过受体介导的内吞作用摄取叶酸偶联药物虽然对叶酸的FR转运到细胞仍然没有确切的机制，但很确定的是叶酸偶联物通 过受体介导的内吞作用不被哺乳动物细胞损伤。然而，也有关于GPI锚定的FR 在内化和转运过程中涉及的与这冲突的机制或途径。因此，早期的研究表明，FR 不与网格蛋白-内陷小窝相关，而是在细胞表面组织形成亚微米结构域。这些研 究也表明，GPI锚可能负责介导受体聚类与称为小窝的瓶形膜结构相联系。并进 一步提出FR的内化是通过被称为摄液作用
12、过程的小窝的挤压来完成。然而，后 来的研究表明，GPI锚定的FR大多不发生在小窝，并且受体可能是弥漫性分布 在质膜上，直到叶酸屏蔽。更多最近的研究结果似乎表明，FR是由其GPI锚定 在脂筏或膜受体丰富的复合物上，并且这些亚结构域（直径70 nm）并没有小 窝，而富含鞘脂和胆固醇。不管进入的路线，很明显地是生理叶酸跨越细胞膜进 入细胞质是通过一种FR介导的专门的内吞途径来完成。与在癌细胞表面的FR结合后，叶酸偶联物，无论大小怎样，都可以内化到 细胞内称为内涵体。内涵体中的叶酸偶联物的PH值在4.3和6.9之间（更多的 是在5.0），这一过程称为内涵体酸化。由于叶酸与其受体结合具有PH依赖性， 在
13、PH5时急剧下降，因此可以预测，一些的叶酸偶联物将与其受体分离并保持 在细胞内。然而，叶酸共轭卸载效率的直接测量表明，只有15%到20%的结合 到受体上的叶酸偶联物释放到细胞中，其余的显然循环到FR的细胞表面。相关 研究也表明，叶酸偶联物内化的总数与一个细胞中FR表达的数量成正比，FR 表达的癌细胞平均可以吸收叶酸偶联物的速度大约是1-2 X105分子/细胞/小时。24叶酸偶联物在体内肿瘤选择性的研究在荷瘤小鼠身上使用低分子量的叶酸药物证明了叶酸偶联物在体内的肿瘤选择 性。事实上，事实上，随着对几代以这种叶酸为基础的放射显影剂络合多种放射 性核素（125I,67Ga, min/gmTc）的研究
14、，两种水溶性的结合物，In-二乙三胺 五乙酸（DTPA）-叶酸和99mTc-叶酸偶联物（EC20，细胞内含物，西拉法叶，美 国），在人体临床试验中是合格的。在疑似卵巢癌的妇女身上，静脉注射 iiiIn-DTPA-叶酸后发现主要集中在腹部肿块，这些肿块随后被确诊为恶性细胞。 显像剂的准确性和检测灵敏度是非常有效的，因为在良性肿瘤患者中，几乎没有 摄取量。此外，除了恶性肿块，只有在肾脏和一些患者的肝脏中显示有mIn-DTPA 叶酸显著存在。在肾脏的摄取量可以很快预测，因为已知的FR表达在近端小管 顶膜（低分子显像剂迅速排泄到尿液中，在那里他们可以很容易地靠近肾FR）。 但在一小部分患者中肝脏的摄取
15、预测不到，后来被证明是来自活化巨噬细胞表面的FR （即，枯否细胞），这可能会在应对某些类型的炎症刺激中有活性。因为 静息巨噬细胞不结合叶酸或叶酸偶联物，并且由于占据叶酸偶联物的激活的巨噬 细胞可以被其他静止的巨噬细胞所代替，所以，在激活的巨噬细胞中，叶酸偶联 物的传递可能不会构成严重的健康危害。3叶酸介导的大分子疗法如图3所示，叶酸靶向在传递大分子治疗药物到癌细胞的应用可分为两类，因为 药物需要细胞内释放出来发挥其细胞毒性/监管职能，FR提供了一种进入癌细胞 的胞浆的配体激活的内吞途径。属于这一类的大分子的例子包括大多数蛋白毒 素、药物包封脂质体的寡核苷酸、基因治疗载体和许多其他胶体药物载体。
16、虽然 很少有研究探讨及叶酸偶联高分子的胞内运输机制，但已经证明的是胞内释放可 能不遵循游离叶酸的机制，而是取决于在其他细胞器膜分解循环过程中的某种缓 慢非特异性逃避。另一方面，由于药物不需要细胞内卸载，但能够介导细胞毒作 用于靶细胞表面，FR可以作为肿瘤标志物，允许药物集中在肿瘤细胞表面。这 一类的治疗药物的例子可能包括前药活化酶和刺激或重定向对癌细胞的免疫系 统的免疫治疗剂。重要的是，细胞表面只有一小部分FR的连续循环允许有待开 发的两种靶向策略。更重要的是，由于叶酸-高分子结合物在内化后不能迅速分 解，即使是最敏感的大分子的水解释放系统（例如，蛋白质和基因治疗的载体）， 也有可能被开发。31需要细胞内传递的药物311蛋白质毒素核糖体失活蛋白如植物源性毒素、苦瓜蛋白、和衍生蛋白质、匿名外毒素，是依 赖于FR-介导的内吞作用的第一大分子药物中被成功传递到FR阳性肿瘤细胞的 蛋白。由于苦瓜蛋白和匿名外毒素的重组形式缺乏细胞表面的
