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1、附录A（资料性）胆系上皮类器官培养用主要试剂材料与操作要点1主要试剂材料1.1 培养基主要构成表A1胆系上皮类器官培养基的主要成份表中文名称英文名称培养基AdvancedDMEM/F12谷氨酰胺G1.utaMAX4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液HEPES青霉素/链霉素penici1.1.in/streptomycinN-乙酰半胱氨酸N-acety1.cysteine尼可酰胺Niacinamide无血清添加剂B27表皮生长因子EGF纤维母细胞生长因子IOFGF1.O肝细胞生长因子HGFWnt-3aWnt-3a胃泌素IgastrinIWnt信号通路激活剂R-Spondin1.头蛋白NogginTGFP抑
2、制剂A83-01ROCK抑制剂*Y-27632*分离培养前三天加。1.2 类器官培养3D支架材料3D基质胶提取自基底膜的基质，主要由层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。基质胶在室温条件下聚合形成具有生物学活性的三维支架，模拟体内细胞外基质的结构、组成、物理特性和功能。该结构不仅有利于体外细胞的培养和分化，而且能够为胆系上皮细胞的生长提供支架。基质胶在零度以下低温环境呈液态，故凡是涉及基质胶的试验操作皆应置冰盒操作。1.3 组织消化酶胆系上皮组织消化中涉及的消化酶主要有IV型胶原酚(co1.1.agenaseIV)和ACCUIase。其作用是水
3、解胆道系统ECM中的胶原蛋白成分，从而使胆系上皮组织与其他结缔组织分离出来，以及上皮组织消化为小细胞片段。1.4 类器官冻存液类器官冻存液为无血清冻存液，一般宜含有10%的二甲基亚碉(DMSO)o2胆系上皮类器官培养操作要点2.1 类器官污染的处置胆系上皮类器官培养过程中应定期观察、拍照。一般在第2天于倒置显微镜下可以观察到类器官小球，随着培养时间延长，类器官小球逐渐增多、增大。定期观察有利于及时发现污染。如果在培养3天内出现基质胶浑浊，提示可能有霉菌和细菌污染，应及时做丢弃处理。在类器官培养过程中也有可能出现支原体污染。支原体在培养基上呈现团状、小球状生长，容易与类器官混淆，但支原体在显微镜
4、下观察不到上皮的组织细胞结构。若发现可疑支原体污染，可加入支原体去除剂进行挽救，支原体去除剂可以抑制并消除支原体的生长，若仍不能去除支原体污染则做丢弃处理。2.2 类器官培养物接种注意事项将获取的细胞悬液与3D基质胶按照1:1混匀吹打:吹打过程中切忌产生大量气泡，以免影响后续培养物接种。24孔板可提前于37C培养箱预热30min,以加速3D基质胶的凝固。2.3 类器官传代注意事项胆系上皮类器官可以连续传代超过10代或持续培养6个月以上。与类器官有关的试验研究宜在连续传代10代以内或者持续培养6个月内进行。3类器官冻存注意事项冻存前每孔加入5001.的OrganOidharvestingso1.
5、ution,将类器官吸至试管内，按照501.胶加5001.的organoidharvestingso1.ution置于冰上60min,去除基质胶，离心清洗后，加入ACCUtaSe消化3-5min,使其消化成单细胞悬液，10OOrPm离心5min。弃上清后加入适量类器官冻存液混匀，分装于ImI低温冻存管中，放入程序性冻存盒内于-8(C深低温冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。4类器官复苏注意事项从液氮罐中取出的类器官冻存管要快速放入37C水浴锅中令其尽快融化。吸出类器官冻存物移至15m1.无菌离心管中，再加入10倍体积的AdVanCedDMEM/F12培养基混匀。之后操作同前述的类
6、器官传代培养过程附录B（资料性）STR检测首先了解下STR检测流程，先提取细胞DNA,然后进行PCR扩增及测序，最后进行结果分析。详细检测流程请看下图：试剂配制提交结果电泳DNA提取PCR扩增受检细胞STR位点的基因分型数据与其对应的标准细胞系（其原始组织或衍生细胞系）STR基因分型数据进行比对：1若两者的匹配度80%,则判定受检细胞系为标准细胞系或为标准细胞系的衍生细胞系。2若两者的匹配度在56%-8O%之间，建议结合细胞系形态、细胞系特异性标记物等辅助分析进行综合判断。3若两者的匹配度56%,则判定受检细胞样本与其对应的标准细胞系不相关。附录C（资料性）染色体核型检测1 .试验当天保证细胞
7、处于对数生长期，一般一个6cm的培养皿80%的密度能做一次试验。2 .将待测细胞从37C,5%Co2培养箱中拿出，添加秋水仙素（终浓度为0.2ugm1.）,摇匀后37孵育1-2小时。3 .等待的同时，配制低渗溶液0075MKC1.（配制:8m1.无菌水+44.7mgKC1.）,放入37水浴预热。4 .孵育后的细胞用胰酶消化，1200转/分，离心5min,收集于离心管中，去除上清液，用8m1.低渗液重悬，打匀后放37水浴箱40min05 .加入新鲜配制的固定液（甲醇/冰乙酸=2131）2m1.混匀，室温下放IOmin后，IOOo彻分离心IOmin,去上清液（留500u1.,先将底部细胞吹匀），新
8、加入8m1.固定液，1200转/分，离心IOmin,重复三次后，滴片，放入80烘箱老化3小时。6 .再将烤干的玻片放入新鲜配制的胰酶（0.25%）中消化Imin（严格控制时间）后，再放入吉姆萨染液中染色5-10分钟（先用1片染5min,根据颜色调整后面的染色时间），取出用流水冲去染液后，在显微镜下观察结果。附录D（资料性）胆系上皮类器官鉴定1 类器官显微镜下状态评估将胆系上皮类器官培养板置于倒置显微镜下，在2够视野下计数类器官数目。类器官数目不少于60个/视野表明类器官生长状态良好。生长活力好的类器官平均直径约为IOOHm-200um。若个别类器官体积过大（可达IOOoHm）则提示类器官趋向衰
9、老，应尽早传代，以防止衰老的类器官影响类器官传代。2 类器官存活率评估2.1 原代组织消化胆管及胆囊组织酶解后获得单细胞悬液，采用采取台盼蓝（TryPanb1.Ue）染色进行活细胞计数。将离心后的细胞沉淀用AdVanCedDMEM/F12培养基重悬（约IooU1）,经吹打均匀后吸取18u1置于1.5m1.的EP管，向EP管中加入2U1.的0.4%的台盼蓝染液充分混匀，染色3min,取IOUI细胞悬液加入血细胞计数板，在倒置显微镜IOX物镜下计数，分别计数四大格中未染成蓝色和染成蓝色的细胞总数。利用如下公式计算每IoOg体积中细胞总数和细胞存活率：总数/100U1=（未染成蓝色细胞数+蓝色细胞数
10、）/4）X1031.i1.细胞存活比例二未染成蓝色细胞数/（蓝色细胞数+未染成蓝色细胞数）X100%活细胞比率应90%可用于类器官细胞培养。2.2 类器官传代及冻存复苏类器官传代前、酶解为8-10个细胞的细胞以及复苏后，应用1.IVE/DEAD细胞成像试剂盒测定类器官细胞群中的活细胞（绿色）和死亡细胞（红色）组分，荧光显微镜拍照统计分析存活率。3 类器官的形态学及免疫标记鉴定胆管胆囊组织及胆系上皮类器官成功构建后，通过制备冰冻切片或者石蜡包埋切片，进行苏木素/伊红染色（H&E）进行形态学鉴定，通过免疫荧光或者免疫组化染色进行生物标志物检测。干细胞标志物CKI9、EpCAM.FoXA2、SOX9
11、SoXI7、1.GR5,胆管标志物CRTF,功能标志MUC1.,紧密连接蛋白ZCM。同时进行类器官整体染色：培养大小约IOO-200Um的类器官，加入OrganOidharVeStingSOIUtion,置于冰上放置Ih以溶解基质胶，预冷PBS漂洗类器官，低速离心（60OrPm）2次。加入0.125%Tri1.onX-IOO破膜液，室温作用IOmin,室温PBS漂洗3次后封闭用血清（10%二抗血清）封闭1.h,将类器官分别放置相应染色组别的共聚焦小室中，10%二抗血清作为配制一抗的稀释液，根据不同稀释比配制一抗抗体组合，滴加一抗，4孵育过夜后PBS漂洗3次。不同组别分别滴加各种荧光标记的二抗，
12、室温避光作用IkPBS漂洗3次后加入DAPI衬核液，室温作用IOmin后PBS漂洗3次。加入水性封片剂，避光湿盒保存，共聚焦显微镜下观察采集图像并三维重建类器官结构。附录E（资料性）类器官的核酸与蛋白质提取I类器官的核酸与蛋白质提取1.1 类器官需要先消化制备为细胞悬液，然后在11,20OXg离心Imin,弃上清，加2001.悬浮细胞缓冲液GA,振荡使细胞彻底悬浮；1.2 加入201.蛋白酶K（ProteinaseK）溶液，混匀；1.3 再加入2001.核酸与蛋白分离缓冲液GB,充分颠倒混匀，70放置IOmin,溶液应当变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；1.4 加入2001.无水乙醇，充分
13、振荡混匀15sec,此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；1.5 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），13,40OXg离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；1.6 向吸附柱CB3中加入5001.去除蛋白质杂质缓冲液GD（已按照说明加入无水乙醇），13,40（）xg离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；1.7 向吸附柱CB3中加入6001.去盐漂洗液PW（已按照说明加入无水乙醇），13,400xg离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；1.8 重复操作步骤1.7；1.9 将吸附柱CB3放回收集管中
14、，13,40OXg离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；1.10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-2001.的DNA洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min,13,400xg离心2min,将溶液收集到离心管中。2RNA提取2.1 收集细胞：待类器官长到一定的数量后，将24孔板中的培养基去除，加入ImI的PBS进行清洗1遍。去除PBS后，加入Im1.的无动物源性重组胰酶，并用Im1.量程的移液枪将基质胶打散，以利于消化酶与类器官进行充分的接触与消化。30min后，将细胞溶液转移至RNaSe-Free的离心管中
15、离心（300g,5min）,收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清；2.2 裂解处理：轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液R1.（3501.）,旋涡震荡；2.3 将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），13,40OXg离心2min,收集滤液；2.4 向滤液中加入1倍体积70%乙醇（通常为3501.或6001.）,混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中（吸附柱CR3放入收集管中），13,40OXg离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.5 向吸附柱CR3中加入3501.去蛋白液RW1.,13,400xg离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.6 DNaseI工作液的配制：取101.DNase1储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入701.去除DNA缓冲液RDD,轻柔混匀；2.7 向吸附柱CR3中央加入801.的DNaseI工作液，室温放置15min；2.8 向吸附柱CR3中加入3501.去蛋白液RWI,13,40OXg离心30-60sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；2.9
