细胞冻存和复苏

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1、细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代 保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则冻存细胞的理论基础 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶 性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相 反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过 程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存方法预先配制冻存液： 20%血清培养基10%DMSO （二甲基亚砜） 取对数生长期细胞 1ml 于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制

2、成细胞悬液（1X1065X 106细胞/ml）,密封后标记冷 冻细胞名称和冷冻日期。慢冻程序标准程序（放哪里？）当温度在-25 C以上时，1-2 C/min当温度达-25 C以下时，5-10C/min当温度达-100C时，可迅速放入液氮中简易程序将冻存管于4C放置1小时，于-20C放置1小时，通过线绳将 装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70C）,放置1小时，后直 接投入液氮中（-196C）细胞复苏方法从液氮中取出冻存管，迅速投入37C水浴中，使其融化（1分钟左右）注意防护（冻存管爆炸）！5 分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上低速离心10分钟去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 低温保

3、护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细 胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内 水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减 少冰晶对细胞的损伤。注意事项： 在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。 高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下， DMSO 对人体有毒，故在配制时最好带手套。在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐 内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻 手套、面罩、工作衣或防冻鞋

4、。应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还 要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细 胞冻存一段时间后，要复苏12管，以观察其活力以及是否受到微 生物的污染。冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要 从-196 C的液氮中取出冻存管，立即投入37C温水中，温差很大， 玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混 入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物 （真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质和细胞（非同一种的其他 细胞）。微生物污染的途径 空气：微生物传播的最主要途径

5、。器材：清洗消毒不彻底。 操作：无菌观念不强，操作不规范。血清：支原体或病毒污染。 组织样本：造成原代培养污染。微生物污染对细胞的影响 体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力； 培养基中加入的抗生素的抗污染能力有限； 培养细胞一旦发生污染，多数将无法挽救； 污染早期或污染程度较轻时，及时处理，部分细胞有可能恢复。 污染物持续存在对细胞的影响： 轻者细胞生长缓慢，分裂相对减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞质 中出现较多的颗粒状物质； 重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变 圆或崩解，从瓶壁脱落。微生物污染的检测真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进 行细

6、胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孢子霉、毛 霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小 点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、 管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排 列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小， 有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶 外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但 最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液 中加入了抗菌素 （一般为预防剂量 ）

7、，也可能因为操作不慎而引起污 染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌 等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以， 每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗， 最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株（系）丢失。支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小 直径0.2“m, 般过滤除菌无法去除干净，光镜下难以看清它的形 态结构。开始不易发现，能在偏碱条件（pH7.6 8.0）下生存，对青霉 素有抗药性。多吸附于细胞表面

8、或散在于细胞之间。电镜下可见其有 三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变 慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或 略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。病毒污染 采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织 培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不 少于 20 种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生 产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴 细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。 因此，潜在病毒是细胞大量

9、生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的 难题。非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分 开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类” 细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物。目前，世界上已有几十种细胞都 被 HeLa 细胞所污染，致使许多实验宣告无效。化学成分的污染 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由 于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。 污染的鉴别1、细菌、真菌污染的检测（1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性 操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在 48 小时内可明显观察 到。如培养液变混浊，

10、或略加振荡有很多漂浮物漂起。（2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球 状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵 形的物质常为真菌污染。（3）接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接 种，也可发现是否有污染。支原体污染的检测（1）相差显微镜观察 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物 （一般用长形盖玻 片），24 小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放 置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物 培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支 原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见

11、类似 于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区 别（2）低渗溶涨处理地衣红染色观察 固定染色法，通过对细胞低渗处理，使细胞体积扩张，细胞膜 表面的褶皱和结构减少，使附在细胞表面的支原体容易被识别。取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的 0.5% 枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次，每次10 分钟，取出盖片凉干。用培养液时，先吸取ImL, 500800r/min离 心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置 10分钟，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物， 制成23张涂片。然后用2%醋酸地衣红（地

12、衣红2g,冰醋酸60mL， 加蒸馏水至100mL ）染5分钟。纯酒精过三次，每次1分钟,圭寸入Euparal 或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。镜下观察见 支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。（3）荧光染色法观察用荧光染料Hoechst33258,此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为： 用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满 前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾 固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50 “ g/mL的Hoechst33258（生 理盐水配制）中染色10

13、分钟，置于蒸馏水漂洗12 分钟，向细胞面 滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培 养液，先离心去除上清液，再加入 Hanks 液漂洗，离心弃上清后加入 1:3 醋酸甲醇固定 10 分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用 Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水， 加 35 滴 pH5.5 磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸 出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈亮绿色 小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。（4）电镜检测 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一 般在细胞培养4872小时，细胞接近汇合前，用胰酶消

14、化细胞制成 细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方 法同细胞形态观察法。（5）培养检测 将2.5X109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤 培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉 汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50C的培养基中， 再用琼脂培养基做分离培养，37C培养3天观察有无“荷包蛋”菌落 出现。污染的清除和预防污染的清除培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大， 宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作 室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重 新得到，可采取以下办

15、法清除。1 、使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防 用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素 （青霉素 100u/mL加链霉素100“g/mL）,污染后清除用药需采用大于常用量5 10倍的冲击处理，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。 此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还 可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400-800M g/mL卡那霉素或200p g/mL四环素处理，每隔2-3日换 液 1 次，传 1 2 代进行治疗。2、加温处理将污染的组织培养物放在41C培养18小时，可杀死支原体， 但对细胞有不良

16、影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度 杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用 药物处理后，再以41C加温处理效果更佳。3、使用支原体特异性血清用 5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑 制支原体生长，故经抗血清处理后 11 天即转为阴性，并且5 个月后 仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。4、其他方法 除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法 等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别 重要价值，一般均弃之重新培养。污染的预防 预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防 工作做在前，才能将发生污染的可能性