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1、实验二 培养基制备和灭菌技术一、实验目的1学习一般培养基的制备方法。2掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用的灭菌方法。二、实验原理（一）培养基培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工的方法配制而成的一种基质。它是微生物的生活环境，各种微生物对养分和培养基的物理、化学要求条件不一样，为了分离、培养、鉴定、保藏和研究不同种类的微生物，就应当根据它们的需要，配制合适的培养基。微生物在培养基上生长发育，必须在一定的最适酸碱度范围才能表现出它们最好的生命活动力。不同的微生物对酸碱度的要求不同，因此，我们在配制培养基时，必须调节培养基的pH值。培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，
2、可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基。1天然培养基:主要成分是复杂的天然有机物质配制而成，如马铃薯、玉米粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等，这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定的天然有机物质配制成的培养基，如牛肉膏蛋白胨、马铃薯、麦芽汁培养基。它适用于生产上大规模培养微生物。2合成培养基:合成培养基是用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，也称化学成分明确的培养基，例如高氏一号培养基、查氏培养基等。一般适用于在实验室范围内研究微生物的形态、代谢、分类鉴定、生物测定、菌种选育和遗传分析等工作。3半合成
3、培养基:在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，因此，应用广泛，如马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基，大多数霉菌都生长良好。4固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基，常用凝固剂有洋菜、明胶、硅胶，硅胶用于配制自养微生物的固体培养基；对于其他多数微生物来讲，洋菜最为合适，一般加入1.52.5%即可凝固成固体，如牛肉膏蛋白胨培养基等。此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保存等。5半固体培养基:在液体培养基中加入少量凝固剂即配成为半固体培养基，如加入0.20.7%洋菜作为凝固剂。用来观察细菌
4、运动特征、菌种鉴定、菌种保存和噬菌体的效价测定等。6液体培养基：不加任何凝固剂配好后成为液体状态的培养基。如糖发酵液体培养基、蛋白胨水培养基等。常用于大规模的工业发酵生产、遗传学研究、生理代谢等基本理论的研究工作。根据培养基的特殊用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。(1)基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质，常用的基础培养基是牛肉膏蛋白胨培养基，也是作为某些特殊培养基的基础成分。(2)加富培养基：是在基础培养基中加入血、血清，动物、植物组织提取液，主要用于对培养某些微生物要求比较苛刻的营养。(3)选择培养基 是根据某一类或某一种微生物的特殊营养要求或对一些物
5、理、化学条件的抗性而设计的培养基。一种是根据某些微生物对碳、氮源等营养的特殊要求所设计的选择性培养基，就可以分离到能分解某些物质的微生物。如以纤维素作唯一碳源的选择性培养基，可以分离到分解纤维素微生物；无氮培养基可以分离到固氮微生物。另一种是根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性而设计的培养基，最常用的是在培养基中加入某些化学物质，以抑制不需要的微生物的生长繁殖。如在分离放线菌时，在培养基中添加10%的酚或链霉素数滴可抑制细菌和霉菌的生长，又如分离霉菌的马丁氏（Martun）培养基。(4)鉴别培养基 是在基础培养基中加入某种化合物或化学试剂，某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢
6、产物与某种化合物或化学试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与其他种微生物区别开来，如糖发酵培养基、伊红美蓝培养基等。 （二）灭菌消毒与灭菌两者有不同的概念。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，而不能杀死全部芽孢，因此，消毒只是一种常用的卫生措施；灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子，因此，灭菌后的物品是无菌的。灭菌的方法很多，有加热、过滤、照射和化学药品等。1加热法：又分干热灭菌和湿热灭菌两种。(1)干热灭菌：有火焰烧灼和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具（如镊子）等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上短暂烧灼灭菌。我们
7、通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿（如吸管和培养皿）等的灭菌，在热空气160170下保温2小时进行灭菌。(2)湿热灭菌：高压蒸汽灭菌法。此法时将物品放在高压蒸汽灭菌锅内1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3保持1530分钟进行灭菌，时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以到达彻底灭菌为目的。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。间歇灭菌法。有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用于干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，将灭菌培养基放入灭菌器内，每天加热100，30分
8、钟，连续3天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物去出放37下培养1824小时，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100，30分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍有芽孢，故再重复一次，以达到彻底灭菌。煮沸消毒法。注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间1015分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。表2-1 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含量/%30分钟内凝固所需的温度/505625748018809061450160170表2-2 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度/2
9、/3空气排出时的温度/l/2空气排出时的温度/l/3空气排出时的温度/空气全不排出时的温度/MPaKg/cm2Ib/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.1051015202530108.8115.6121_3126.2130.0l34.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121现在法定压力单位已不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa。表2-3
10、干热湿热穿透力及灭菌效果比较温度/时间/h透过布层的温度/灭菌20层10层100层干热130140湿热105.343861017210170.5101不完全完全2.过滤除菌； 3.紫外线灭菌；4.化学药品灭菌等 三、实验用品(一) 器材 台秤、三角瓶、试管、漏斗、电炉、搪瓷杯（铝锅）、试管架、玻璃棒、滴管、称量纸、pH试纸、棉花、纱布、牛皮纸、棉线、灭菌锅、干燥箱等。 (二) 试剂 NaCl、蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、K2HPO4、HCl、NaOH、洋菜(琼脂)、葡萄糖、蔗糖、NaSO4、黄豆芽、马铃薯等。 四、实验操作 1一般培养基的配制（1）称量：按照培养基配方，称取各种成分。（2）熔化
11、：在容器中先加入所需蒸馏水水量的一部分，依次将各成分加入，使全部溶解，最后补足水量。若用蛋白胨、牛肉膏等物质配制培养基时，需加热溶解，并补足因蒸发而减少的水分。配制固体培养基时，先将上述配好的液体培养基加热到快沸时，再将称好的洋菜(琼脂)加入，继续加热到琼脂完全溶化，在加热溶解过程中要不断搅拌，以免洋菜(琼脂)糊底，同时控制火力，防止培养基沸腾时外溢。（3）矫正pH值：初配制好的培养基，往往不能符合所需求的pH值，因此必须矫正，用精密pH试纸，以1NHCl或1N NaOH调节至所需要的pH值。（4）过滤：用滤纸、棉花或双层纱布过滤。（5）分装：根据不同的需要，可将制成的培养基分装于三角瓶或试管
12、内，分装时取玻璃漏斗一只，装在漏斗架上，漏斗下连接橡皮管与一根玻璃管相接，橡皮管上夹一只弹簧夹，将培养基到入漏斗内，用左手拿空试管的中部，并将漏斗下玻璃管插入试管内，以右手拇指和食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管上端，使培养基流入管内。注意不要使培养基沾污上段管壁及管口，保持棉塞的干净。分装量根据试管大小和实际需要而定。制备试管斜面培养基时，每支的分装量约为管高1/5左右为度，液体培养基分装试管的量以管高的1/4左右为宜，三角瓶的分装量，不宜超过三角瓶的一半。图2-1 培养基的分装 图2-2 斜面的摆法（6）棉塞的制作与灭菌：棉塞要做的形状、大小、松紧完全合适，紧贴管壁不留缝隙，正常的棉塞
13、，头稍大些，约有2/5在外，3/5在试管内，塞好棉塞后，用牛皮纸包扎，置高压蒸汽灭菌锅中灭菌。图2-3 棉塞制作 (引自沈萍等，2001)（7）斜面培养基的制作：固体培养基经灭菌后，如果要做成斜面，则在取出试管后略为冷却，而后放置桌上，管口端放在木条上或其他支持物上，使其倾斜，倾斜度以培养基正好形成斜面为准。（8）无菌试验：培养基经灭菌后，必须先放进37恒温箱内，经24小时后，若无微生物生长才能使用。 2灭菌 灭菌是微生物生产和实验的基本操作技术，其方法很多。因灭菌对象及设备条件不同而适当选用。下面分别介绍几种常用的灭菌方法。（1）干热灭菌 这种灭菌法是利用热空气使物体升温，而导致物体上所带的
14、微生物由于干热脱水而死亡。常用于空玻璃器皿、金属用具等的灭菌，对于带胶皮的物品、液体及固体培养基等不能使用此法灭菌。 使用步骤： 将要待灭菌的器皿（培养皿、吸管等）包扎好，放入恒温干燥箱内。 接通电源，打开开关；将恒温调节器调至160，当达到此温度时，借助恒温调节器的自动控制，保持恒温两小时。两小时后，关掉电源，当温度降至与室温差不多时，打开箱门，去出灭菌物品。1.门拉手 2.箱门 3.观察窗 4.风量调节 5.隔板 6.铭牌 7.密封圈 8.温控 9.开关 10.指示灯图2-4 恒温干燥箱注意事项： 灭菌的器皿必须干燥，否则容易破裂。若没有干燥需预热烤干。 灭菌的温度不能超过180，否则棉花
15、、报纸、牛皮纸要烧焦，甚至发生事故，所以在使用时，要随时检查温度情况，以防自动恒温调节器失灵。 灭菌后，假如温度没下降就打开箱门，冷空气突然进入箱内，玻璃器皿就要破裂；同时，热空气冲出，有灼伤皮肤的可能。因此，必须在温度降至与室温差不多时方可开箱门。（2）高压蒸汽灭菌 此种灭菌方法的原理是在一密闭容器内，煮沸时形成的蒸汽不能扩散到容器外面去，而堆积在密闭的容器内，使蒸汽压力升高，随着水的煮沸，温度也就相应地增高。利用过热的蒸汽来使细菌及其耐热芽孢蛋白质凝固变性，以致失去生命力，从而达到彻底灭菌的效果。 高压蒸汽灭菌是最有效的灭菌方法。一般在1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3保持
