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1、有机酸中柠檬酸的发酵概况【摘要】：有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸 是羧酸，其酸性源于羧基(-COOH)。磺酸(-SO3H)、亚磺酸(RSOOH)、 硫羧酸(RCOSH )等也属于有机酸。有机酸可与醇反应生成酯。羧基是 羧酸的官能团，除甲酸(H-COOH)外，羧酸可看做是羟分子中的氢原子 被羧基取代后的衍生物。可用通式(Ar)R-COOH表示。羧酸在自然界 中常以游离状态或以盐、酯的形式广泛存在。羧酸分子中羟基上的氢 原子被其他原子或原子团取代的衍生物叫取代羧酸。重要的取代羧酸 有卤代酸、羟基酸、酮酸和氨基酸等。有机酸发酵工业是生物工程领域中的一个至要且较为成熟的分 支，在世
2、界经济发展中，占有一定的地位。有机酸在传统发酵食品小 早已得到广泛应用。以微生物发酵法生产且达工业生产规模的产品已 达十几种。用微生物发酵法生产有机酸，以代替从水果和蔬菜等植物中提取 有机酸，是近年来由于社会及市场的需要而开发出的方法由于食品、 医药、化学合成等工业的发展，有机酸需求骤增，发酵生产有机酸逐 渐发展成为近代重要的工业领域。有机酸发酵历史悠久。早在远古时代,人们就巧妙地酿造出不同风 味的酒醋，如葡萄酒醋、米醋和蜜醋等。随着微生物的研究进展陆续 发现霉菌和细菌可以利用葡萄糖等碳水化合物生战各种有机酸如丙 酸、乳酸。本世纪中阐明TCA循环的每一步反应都有相应酶催化如 果用某种方法阻断T
3、CA循环中的某一步反应就会大量积累相应的中间代谢物,现已能用发酵法制备柠檬酸、异柠檬酸、a一酮戊二酸、 琥珀酸、苹果酸等等TCA循环有机酸。【关键字】：有机酸、柠檬酸、发酵【正文】：-：柠檬酸的发酵流程柠檬酸是生物有机体三羧酸循环的中间代谢产物之一，广泛存在 于各种生物体中，特别是柠檬、柑橘、菠萝、李、梅、桃、大花果等 果实中含量较高，某些植物的叶子，如烟叶、棉叶，以及动物肌肉、 骨骼、乳汁、唾液、汗、尿中也存在柠檬酸；1 .原料。工业上生产 柠檬酸所用原料主要有废糖蜜、蔗糖及淀粉质原料如甘薯十。用含淀 粉原料生产时，最好在发酵前先用淀粉酶及糖化酶进行适当的糖化。氮源对柠檬酸的发酵生产特别重要
4、，氨、氢氧化铵或磷酸铵可以 大大提高产量，在代谢中首先形成氨基酸如谷氨酸、廿氨酸及丙氨酸， 这些氨基酸促进了柠檬酸的形成。一些金属离子如钼、铜、锌或钙等对柠檬酸合成有一定抑制作用。 低铁氰化钾K4Fe(CN)6则可以提高柠檬酸的产量，这是由于它可 以沉淀对柠檬酸合成有抑制作用的某些金属盐，如以糖蜜为原料时， 糖蜜中存在大量的锰和铁盐，在80100?温度下可以在15min内被 低铁氰化钾沉淀。此外在培养基中含有1一2mol/L的1，2-*氨基 环己烷一氮、氮一四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及EDTA等时，能促 进黑曲霉合成柠檬酸。2%的甲醇对柠檬酸合成也有利。一些非离解性的表面活化剂，可以在发酵时使
5、菌丝均匀分散于培养液中，从而提高柠檬酸的产量。2. 柠檬酸的静置浅盘发酵静置浅盘发酵即表面发酵法，是在 1923年实现规模生产的，其主要原料是糖蜜。发酵容器为不锈钢等 耐酸蚀的金属盘，盘上有进料口和出料口、无菌空气进出口等，大小 根据条件设计。培养液组成为：12%20%的糖蜜，添加黄血盐、EDTA 或六氰基高铁酸钾、磷酸二氢钾、硫酸锌以及抗菌剂等培养基经灭 菌，调节pH至6. 06. 5，冷却至4550C左右时输入盘内，继续 冷却至3512，以十孢子喷雾接种(100150mg孢子粉/ m2培养基表 面)。培养盘固定在培养室内，培养室具有可以灭菌、保温和无菌空 气供给系统等。发酵温度为3013，
6、发酵过程中通人无菌空气，孢子12d发芽， 然后长成菌盖，发酵周期一般为6 8d，pH降至2. 0，柠檬酸产量 为200250g/L，每百克葡萄糖约生成75g左右的柠檬酸。发酵中 柠檬酸合成高峰时为0. 91. 1k8/m3h，平均合成速率为0. 2 0. 4k8 / m3. ho3. 柠檬酸液体通风发酵(深层通气发酵)发酵基质可以是糖质原 料，也可以是淀粉质原料，在我国一般以甘薯干为原料，这是由于甘 薯十价格低，原料来源丰富，便于贮藏和运输等。柠檬酸深层发酵生产工艺流程：(1) 原料处理薯干粉碎，要求粉碎度要细。(2) 种子制备斜面和茄瓶菌种，用1012Bx麦芽汁加0.1%磷 酸二氢钾作培养基
7、，30C下培养5d，孢子形成丰富。种子罐培养:是种子的进一步扩大，其培养基接近于发酵培养基， 其组成为薯十粉8% 14%，麸皮1 % (或加0.15%硫酸铵)。灭菌后 用茄瓶孢子接种，在32C下通气培养2224h, pH降至3以下，镜 检无杂菌，菌丝生长良好。(3) 发酵生产培养基为18%的薯十粉，为浓醪发酵，灭菌前加 入0. 05%的。一淀粉酶。发酵温度为32C，通风量在12h前为 l:0.1(y:y)，12h 后为 1： 0.2，一 般发酵周期为 112120h。柠檬酸生产方式除上述表面培养和深层通气培养外，还有固体培 养和连续发酵等方法。固体发酵主要用于加工中的副产物如甘薯淀粉 生产中的
8、淀粉渣，果汁生产中的苹果、甘蔗渣等。固体发酵工艺流程4。连续发酵法有许多优点:发酵过程中通过离子交换法不断将柠檬 酸分离出来，发酵液中柠檬酸始终处于较低浓度，加之不断补人糖等 营养物，使菌处于一个适宜的环境中。离子膜分离出的柠檬酸纯度较 高，但此法尚未用于生产。此外，固定化技术应用于柠檬酸生产也是 一个诱人的课题。现在工业生产中仍以深层通气发酵为主，有少数国 家用浅盘培养和固体发酵。(四)柠檬酸的分离提纯柠檬酸的分离提纯有钙盐法、直接提取法、溶媒萃取法以及离子 交换法和渗析法等。1. 钙盐法即是将发酵液中的柠檬酸变成钙盐沉淀，然后用硫酸 将柠檬酸钙置换出游离的柠檬酸，生成的硫酸钙沉淀出来，然后
9、将柠檬酸进一步纯化结晶柠檬酸提取工艺流程(1) 柠檬酸钙的生成发酵结束后，发酵液滤去菌丝，滤液按总酸 量的70%加入碳酸钙粉进行中和，随即将其煮沸，柠檬酸钙沉淀出 来，在95C以上高温时柠檬酸钙溶解度低，而其他有机酸的钙盐溶 解度则较高。然后用9095C热水充分洗涤沉淀，洗净培养基中带 来的糖分和其他可溶性杂质。(2) 硫酸置换反应把热水洗净的柠檬酸钙加水搅成糊状，在搅拌 下加入浓硫酸，温度控制在8013以上，当硫酸加的量能完全满足置 换反应时，柠檬酸游离出来，硫酸与钙离子形成硫酸钙沉淀出来。硫 酸的用量约为加入的碳酸钙的85%90%，如硫酸加入量不足时， 会造成柠檬酸钙反应不完全，余下的柠檬
10、酸三钙混于柠檬酸中，柠檬 酸无法结晶；而硫酸过量时，浓缩过程中酸度增高，当温度升高至 7075 C时，会引起柠檬酸分解，产生蚁酸等挥发酸，产品颜色较深。 在酸解反应中应严格控制温度，在相对饱和度下，温度低时，有多量 可溶性二水硫酸钙存在，混于柠檬酸液中，也影响过滤。在较高的温 度下是以CaS04.1/2H20和硫酸钙的形式存在，溶解度极低，成为沉 淀被过滤除去。(3) 脱色为了得到纯净的柠檬酸结晶，首先须去除色素，脱色的 方法有活性炭脱色和大孔树脂脱色等。(4) 去除阳离子杂质生产中多采用树脂进行离子交换，常用的树 脂为732阳离子树脂，当有pH4的溶液流出时，表示已有柠檬酸流出，开始收集。(
11、5) 浓缩在常压下浓缩易导致柠檬酸分解，应进行减压浓缩。(6) 结晶在缓慢搅拌下冷却结晶，使晶粒均匀。钙盐法的缺点是劳动强度大，设备易腐蚀，提取收率仅70%左 右，同时造成环境污染。2. 直接提取法本法适用于柠檬酸含量高、杂质少的发酵滤液。 可以用以下几种方法得到柠檬酸结晶。(1) 过滤清液先用活性炭脱色去除杂质，浓缩结晶。(2) 用CFC12-CFC12抽提除去蛋白质及其他杂质，将滤液分离出 来浓缩结晶。(3) 以甲醇沉淀滤液中的蛋白质，洗涤沉淀，回收甲醇后浓缩结 晶。(4) 用活性炭将滤液脱色、浓缩，再用3倍量丙酮沉淀蛋白质， 分离、回收丙酮缩结晶。3. 萃取法即用溶媒将柠檬酸从发酵滤液中
12、分离出来，常用的萃 取溶剂有4类：仅含碳、氢、氧的乙酸乙酯、二乙醚、甲基异丁酮； 含磷氧键的磷酸三丁脂；含硫氧键的亚砜；有机胺如三辛胺。 使用时可用正己烷、甲苯、乙酸乙酯、正丁醇等对某些黏度大的萃取 剂进行稀释。萃取中柠檬酸在两相中的分配与萃取温度、柠檬酸浓度以及滤液 中所含杂质等因素有关。4. 离子交换和渗析法提取柠檬酸用弱碱性OH一型701阴离子树脂吸附，用5%氢氧化铵洗脱，得到柠檬酸铵溶液，然后通过强酸性H+型732树脂交换，柠檬酸游离出来。目前，德国和日本的专利采用一种新的C1型阴离子树脂，直 接用盐酸洗脱，简化了操作步骤。二：发酵过程中影响因素1 .通气与搅拌（溶氧）对柠檬酸发酵的影
13、响.黑曲霉是需氧菌.它的生长、繁殖和维持生命活动以及由葡萄 糠转化为柠檬酸时都需要耗用一定的氧气。在一定范围内培养基的溶 氧分压几乎与产酸成正比，溶氧分压低，产酸明显受影响或甚至完全 不产酸。特别是考虑到，在发酵1530h这一阶段，菌体大量生长繁 殖耗氧量最大，而产酸阶段耗氧虽略有减弱，而在这一时期缺氧造成 的损伤是不可逆的。因此在整个发酵过程中一刻也不能停止通气和搅 拌，才能保证溶氧的供应。加大通气或搅拌均可提高溶氧分压，但通 气和搅拌均需耗用大量电能，而且强烈搅拌的剪切力有可能损伤黑曲 霉菌丝，过度的通气不仅易产生泡沫，而且有可能导致降低CO2浓度， 影响CO2固定。因此必须根据发酵设备、
14、培养基以及菌种特性的情况， 合理控制通气和搅拌，既保证所需溶氧的供应，又经济节能。2 .关于柠檬酸发酵菌丝球问题。黑曲霉发酵生产：柠檬酸时，菌丝球的形成与产酸密切相关。 所谓菌丝球是指由许多真菌菌丝缠绕而成的小球，它是由菌球中心向 四周辐射的分支菌丝构成的。菌丝球的大小、结构和数量对产酸有明显影响。发酵过程若产生分支 状菌丝、不成小球，则一般产酸很差;若菌丝球大而结实，产酸也不 好：若菌丝球伸“脚”茵丝太多，产酸也受影响；只有形成小而紧密、 核心部分呈空心状的菌丝球产酸才良好。3 .微量元素与柠檬酸发酵。已知 Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+ 和 S、P、K、Na 等元素都是黑
15、曲霉生长所必需的。但是它们对黑曲霉的柠檬酸生物合 成并非同等重要。Fe2+、Zn2+和Mn2+三种元素对柠檬酸发酵的影响更为显著 Fe2+是生物体内多种酶的组成部分，特别是氧化还原过程必须有铁的 存在，入又是TCA循环中顺乌头酸酶等的激活剂，因此传统亡认为 铁的缺乏是柠橡酸积累的必要条件之一。但事实并非如此简单，只有 在磷、锌、锰等充裕时才呈现这种作用。4 .另外，Cu2+对Fe2+有拮抗作用。Cu2+也是黑曲霉生长所必 需的，它是多种酶的组分，（Cu2+不仅能拮抗Fe2+的作用，对Mn2+ 的负效应也有抵消作用，但高浓度Cu2+对柠檬酸产生也有毒害作用。 Mn2+参与黑曲霉的多种代谢，Mn2
16、+既是异柠檬酸脱氢酶和草酰乙酸 酶的组成都分，又是TCA循环中多种酶的激活剂，还参与蛋白、核酸 的合成，Mn2+浓度高时，柠檬酸合成明显受影响，其作用远甚于 Fe2+。如前所述，Mn2+的不足可使细胞内NH4+浓度升高.从而解 除柠檬酸对酵解途径的抑制作用。三：柠檬酸未来展望柠檬酸是有机酸中第一大酸，广泛应用于食品、医药、日化等很 多领域中。我国柠檬酸年产能已经达到百万吨，占世界的0%左右； 年产量达70余万吨，约占世界的65% ；年出口量50万吨，超过世 界贸易总量的一半。我国是世界上最大的柠檬酸出口国，主要出口到 印度、美国、欧洲、日本等地。我国柠檬酸生产企业众多，厂家遍布全国各地，2001年之前，柠檬 酸企业的数量达到了最多，有120多家，厂家规模、生产能力、产品
