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1、第一章基因工程概述1. 什么是基因工程，基因工程的基本流程基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内, 使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大1. 分离目的基因2. 限制酶切目的基因与载体3. 目的基因和载体DNA在体外连接4. 将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5. 选择、筛选含目的基因的克隆6. 培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件具有对受体细胞的
2、可转移性或亲和性。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。具有合适的筛选标记。分子量小，拷贝数多。具有安全性。2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建（1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。（2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩 散污染环境，保证DNA重组实验的
3、安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数(3) 加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受 体细胞。(4) 在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多 克隆接头(Polylinker)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一 化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。(5) 根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起, 即可构成染色体载体5.
4、什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。6. 入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子，长度为，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性灭活某些与裂解周期有关基因。使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染 现象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口。引入合适的选择性标记基因，如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶
5、氨基端编码序列 (lacZ)的乳糖操纵子片段(lac)、组氨酸操纵子片段(his)以及抗生素抗性基 因等。将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ标记基因内部，使得含有重组子的噬 菌斑呈白色，而只含有载体DNA的混浊噬菌斑呈蓝色。(4)在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列，使得重组 DNA分子的单链形式经分离纯化后，可直接进行测序反应。8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶（Restriction endonucleases）是一类能在特异位点上催化双链 DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段的核酸水解酶。识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点，
6、通常是由4、5或6核苷酸 组成的特定序列（靶序列）。识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈 回文结构。切割位点的规范性：双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可 形成粘性末端或平末端的DNA分子）。同位酶：一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶。同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶（Isocandamers）：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶 称为同尾酶。9. 甲基化酶II类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴，甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同，并在识 别序列内使某位碱基甲基化，从
7、而封闭该酶切口。甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的 同时，却产生出另一种酶的切口甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列，从而使DNA免受相应的限制性核酸内 切酶的切割。甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点。连接酶连接作用的特点： DNA连接酶需要一条DNA链的3末端有一个游离的羟基（-0H）,另一条DNA链的5末 端有一个磷酸基（-P）的情况下，只有在这种情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。 只有当30H和5一P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱 氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。 DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分
8、子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是 双螺旋DNA分子的一部分。 DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA 上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不 能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。 由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连 接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD+或ATP）11. 大肠杆菌DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA。接受模板指导。需要有引物（3羟基）的存在。不能起始合成新的DNA链。催化dNTP加到生长中的D
9、NA链3 -OH末端。催化DNA的合成方向是5T3。Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段，即Klenow酶。分子量为76kDa。Klenow酶仍拥有5T3的DNA聚合酶活性和5T3的核酸外切酶活性，但失去了 5T3的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：修复由限制性核酸内切酶造成的3凹端，使之成为平头末端。以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记。用于催化cDNA第二链的合成。用于双脱氧末端终止法测定DNA的序列。聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：有3T5的核酸外切酶活性和5T3的DNA聚合酶活
10、性。在无dNTP时，可以从任何3 -OH端外切。在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸。在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3粘性末端13, 影响连接效率的因素有：温度（最主要的因素）离子浓度ATP 的浓度（10 M - 1 M ）连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）反应时间（通常连接过夜）插入片段和载体片段的摩尔比DNA末端性质DNA片段的大小14. 如何将不同DNA分子末端进行连接1. 相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割，则不管是单酶酶解还是双酶 联合酶解，两种DNA分子均含有相同的粘性末端，因
11、此混合后能顺利的连接成一个重组DNA 分子2. 平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下，能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分 子，但平末端连接效率不高，基因操作不经常采用。3. 不用粘性末端的连接3端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5端的粘性末端用klenow酶补平，或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1. 该酶用于载体DNA的5末端除磷操作，以提高重组效率；2, 用于外源DNA片段的5端除磷，则可有效防止外源DNA片段之间的连接。16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾。DNA片段3末
12、端的同位素标记。17. 2、细菌转化的步骤：感受态的形成。感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类，负责转化因子的结合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是与 细胞表面受体结合，诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质（如细菌溶素）的合成， 使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等。转化因子的结合。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特 异性结合，单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上。转化因子的吸收。双链DNA分子与结合蛋白作用后，激活邻近的核酸酶，一条链被 降解，而另一条链则被吸收到受体菌
13、中。整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合， 形成整合复合物前体结构，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解， 并将其引导至受体菌染色体DNA处。转化因子单链DNA的整合。供体单链DNA片段通过同源重组，置换受体染色体DNA 的同源区域，形成异源杂合双链DNA结构。+诱导转化原理： 在0C的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液 晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附 在细菌细胞膜的外表
14、面上。当42C热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生 剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细 胞，可以提高DNA的转化效率。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。介导细菌的原生质体转化PEG是乙二醇的多聚物，存在不同分子量的多聚体，它可改变各类细胞的膜结构， 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组，此时相互接触的两 细胞的胞质沟通成为可能，从而造成细胞之间发生融合。20. 电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，在质膜上形成纳米大小的
15、微孔，DNA直接通 过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中， 这种方法称为电穿孔法。P52接合转化，入噬菌体感染未归纳21. 转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体。 插入片段大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22, 转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化 操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37C培养一个小时原生质体转化后的再生过程入噬菌体转染后的30C培养等，均属扩增操作扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序。扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选。表达外源基因，便于筛选和鉴定。23, 抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选
