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1、细胞周期负反馈调控通路的研究进展 作者：袁晓华 张焕铃 刘福英【关键词】 ARF;INK4a;RB ;E2F1 1 P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53的相互制约关系鼠双微体(MDM2)基因,最初由Donna Geroge及其合作者在自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来。 MDM2具有在细胞核和细胞质之间穿梭的功能,人类的MDM2定位于染色体12q1314，MDM2的(1)区内具有核定位(NLS)与核输出(NES)序列，利用其NLS序列与细胞核内的P53相结合,然后利用其NES信号,将P53运到胞浆,再通过其自身的E3泛素连接酶活性,使P53蛋白泛素化而降解。
2、然而P53的活化又能促进MDM2的转录，这样就在P53与MDM2之间形成一个负反馈环，这对于维持MDM2与P53之间的平衡非常重要。最近研究发现的一种小分子物质Nutline，是顺式咪唑啉的衍生物，可以抑制MDM2的功能。Nutline可以通过细胞膜进入细胞内，从MDM2的P53结合域的疏水口袋里将P53替换出来1。人类基因P16(INK4A)位于染色体9p21，由于mRNA的不同剪切，其编码的基因产物有两种，即P16INK4A和P19ARF,外显子1通过剪切与外显子2 、3相连形成了P19ARF的mRNA,而P16INK4A选择了外显子1和外显子2 、3,做为其mRNA的拼接方式，两种产物共
3、享外显子2和3,外显子1和1分别由各自独立的启动子启动。P19ARF能通过与MDM2相结合，加速MDM2的降解，从而稳定P53蛋白，使P53积累。而P16INK4A同周期蛋白D竞争性的与细胞周期素依赖性激酶(CDK)结合，抑制cyclinDCDK4/6的活性。正常情况下，视网膜母细胞瘤蛋白(RB)存在于整个细胞周期中，它能与许多转录调控因子结合，它的结合能力受自身磷酸化状态的限制，只有非磷酸化的RB才具有抑制细胞增殖的活性，具有G1S、G2M期的细胞阻滞活性。非磷酸化的RB和E2F结合，抑制细胞的转录。而cyclinDCDK可使RB磷酸化导致RBE2F解离，释放E2F，E2F参与基因的转录,协
4、助细胞通过G1期。P16INK4A同周期蛋白D竞争性的与CDK结合，抑制cyclinDCDK4/6的活性，从而抑制RB的磷酸化，使RBE2F复合物发挥其抑制转录的活性。P21cip1与P27kip1都是周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白，可以与cyclinCDK复合物结合。cyclinD在G1期早期表达，跨越整个G1期;而cyclineE在G1期末表达，在G1/S交界处急剧升高达高峰。P21cip1与P27kip1和cyclinDCDK4/6结合则稳定并激活cyclinDCDK4/62，P21cip1与P27kip1与cyclineECDK2结合则会抑制cyclineECDK2的活性，cyclin
5、eECDK2是G1/S相转换调控的汇合点，如果P21cip1和P27kip1被cyclinDCDK4/6捕获，使得cyclineECDK2的活性得到释放，cyclineECDK2进一步磷酸化RB，释放E2F，细胞进入S期。P16INK4A可以通过破坏cyclineDCDK的复合物，释放P21CIP1和P27KIP1,抑制cyclineECDK2，进而抑制了RB的磷酸化。所以说P16INK4A是间接抑制cyclineECDK2的活性2，3。如果没有P21cip1或P27kip1就不能体现出P16INK4A的活性。P21cip1和P27kip1基因敲除鼠的成纤维细胞cyclineD1CDK4复合物
6、的水平下降，人为的提高CDK2的活性，仍然不能对P16INK4A所诱导的细胞周期阻滞产生应答2，3。所以说RBE2F将P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53这两条通路联系在一起2，4。P53所诱导的蛋白P21CIP1能够抑制cyclinECDK2的活性，使RB保持非磷酸化状态，与转录延长因子E2F相结合，发挥其细胞周期阻滞的作用。如果P53的活性降低，不能有效诱导P21CIP和P27CIP的表达，恢复E2F的活性，那么细胞周期就会绕过P16INK4A诱导的细胞周期阻滞这条通路4，RB失去活性释放E2F，可以诱导P53的表达，但是保持RB与E2F的结合，来抑制E2F的活性，是P
7、19ARF和P53所介导的细胞周期阻滞所必需的。如果细胞RB基因家族全部缺失，将会对P19ARF的诱导凋亡作用产生抵抗5，6。P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53这两条履行细胞增殖调控的通路是相辅相成缺一不可的，任何一条通路的阻滞，都能让细胞的周期出现紊乱。2 E2F诱导凋亡的通路最近研究发现，E2F1的过表达可以诱导凋亡，E2F/的小鼠，表现胸腺细胞过多，这可能与未成熟前生长素应答因子(ARF)和P53的功能不能得到有效诱导有关。然而这种现象同样发生在已经衰老的E2F/小鼠，说明E2F1可以促进肿瘤细胞的凋亡79。前面提到Nutlin可以抑制MDM2的功能，在那些没有发生
8、P53突变的癌细胞中，可以利用Nutline来解除MDM2对P53的抑制作用，恢复P53的转录激活作用。然而研究发现在P53缺失的结肠癌细胞(HCT116)中，这种小分子物质仍然能在某种程度上诱导凋亡。这种凋亡是依赖于E2F1所诱导的凋亡10。事实上MDM2也存在非依赖P53的途径，它可以和许多蛋白相结合，包括P14ARF、pRb、P73、E2F1/DP1等10。MDM2与E2F1/DP 的结合可以刺激E2F的转录激活作用。Nutline与MDM2的结合可以抑制MDM2与E2F1的结合，使E2F1得到释放，在DNA损伤的情况下来诱导前凋亡基因P73、NOXA的表达，进而诱导凋亡11。E2F1可
9、以和ARF的启动子特异性结合，诱导ARF表达，来增强P19ARFMDM2P53通路的细胞周期阻滞的功能。E2F1可以诱导P53凋亡刺激蛋白(ASPPS)的表达，ASPPS是P53的辅助因子可以增强P53的转录激活作用12，13。E2F1可以协同P53来诱导前凋亡基因的表达如：PERP 、SIVA、APAF、具有(BH3)同源结构域蛋白、PUMA、NOXA 。E2F1 还可以诱导P73的表达，以一种非依赖P53的机制来诱导凋亡。DNA受损伤后，E2F的表达量增高，可以激活ATM/ATR，chk1和chk2使E2F1的N末端结构域磷酸化，这样避免了E2F1被泛素化而降解，然而这种磷酸化同样发生在C
10、末端的364位丝氨酸位点，这两种磷酸化综合起来，对E2F1稳定性的影响还不能确定。但能确定的是E2F1的诱导凋亡的作用增强了，ATM/ATR可以进一步磷酸化P53,稳定P53四聚体的结构，促进P53发挥诱导凋亡的作用14。在DNA 受损伤以后，E2F被乙酰化，乙酰化可以稳定E2F1，同时刺激它的转录激活作用，有趣的是，P/CAF导致的E2F1的乙酰化可以增加E2F1对靶基因的选择性。尤其是其对前凋亡基因的选择如P73、APAF1。E2F1的过表达促进P53的磷酸化和稳定，这种效应不依赖ARF15。可能E2F过表达本身就促进DNA损伤，通过诱导无节制的DNA复制来实现DNA的损伤，这与Heman
11、n提出的假说16看法一致，也就是癌基因所诱导的增殖可以导致DNA损伤和细胞老化两种结果。Hallstorm与Nevins鉴定出Jab1蛋白可以和E2F1相互作用来增强其诱导凋亡的作用，而Jab1并不增加E2F1所介导的促进细胞增殖的作用17。研究发现抗凋亡蛋白Api5,它可以抑制E2F1所介导的凋亡，但它不影响E2F1所介导的转录，目前其作用机制还不清楚18。3 ARF的非依赖P53的调控通路ARF也有不依赖P53抗细胞增殖功能。MDM2、ARF、P53三种基因都缺失的小鼠比单独缺失ARF 或P53的小鼠发生的肿瘤种类和数目要多。这种三种基因都缺失的小鼠肿瘤发生的速度快，而且肿瘤遍布全身不同的
12、组织和脏器。这些组织包括间质细胞、表皮细胞、造血细胞、神经细胞。因此，ARFMDM2P53通路并不是严格的线性关系4。在P53功能缺失的鼠胚胎成纤维细胞中，ARF仍然能够抑制鼠胚胎成纤维细胞的增殖。自由状态的E2F1增多可以诱导ARF的表达，ARF反过来可以和E2F1相结合，来抑制E2F1的转录激活作用。ARF还可以和E2F1的功能伴侣DP1相互作用，促进后者进入核仁而被蛋白酶体水解，但ARF对E2F1/DP1复合体不起作用19。ARF通过阻止早期核糖体的成熟来发挥其细胞周期阻滞的作用。NPM/B23在核仁中含量较高，它可以通过RNAase来指导rRNA前体的分裂，ARF 通过N 端的214个
13、氨基酸和NPM/B23的B23的寡聚区相结合，来影响rRNA的加工20。ARF促进小分子的泛素修饰物(SUMO)与解旋酶WEN结合，这种结合方式类似于MDM2与P53的结合，使WEN在细胞核内重新分布，在某种程度上制约S期的复制。ARF还可以和Cmyc的亮氨酸拉链和转录调控结构域相结合阻止其转录激活，对抗Cmyc诱导细胞分化增殖的功能，但ARF并不影响Cmyc的诱导凋亡的功能21。在P53/P21通路缺失的细胞中ARF可以诱导G2/M期阻滞，ARF通过抑制P34cdc2激酶，同时下调cdc25,使P34cdc2的酪氨酸磷酸化，从而使细胞阻滞在G2期22。4 结 语P16INK4ACDKsRB和
14、P19ARFMDM2P53是两条经典的细胞周期调控通路，它们通过RBE2F1汇合于一点，在细胞周期调控中发挥着相辅相成的作用。在许多癌细胞中都发现了这两条通路的功能发生异常，RB的缺失突变、CDK4的过表达或突变、P16INK4A的点突变、P53的突变或缺失、MDM2过表达、P14ARF缺失都能导致这两条通路发生功能异常。然而这两条通路并不能完全解释细胞周期调控的现象。最近研究发现的E2F1除了促进细胞增殖还可作为一种肿瘤抑制因子，诱导细胞凋亡79;ARF的非依赖P53细胞周期调控作用都是对这两条通路的有效补充。两条经典通路中是否还涉及其他未知的分子?E2F1是如何行使促进细胞增殖和促进细胞凋
15、亡的两种截然不同的功能?除了前面提到的分子，ARF还和哪些分子相互作用来发挥其不依赖P53的细胞周期调控功能?这些问题都有待于进一步研究。【参考文献】 1 Mills AA，Zheng B，Wang XJ,et al.P63 is a p53 homologue required for limb and epidermal morphogenesisJ.Nature，1999;398(6729):70813.2 Cheng M,Oliver P，Diehl JA,et al.The p21(Cip1) and p27(Kip)1 CDKinhibitorsare essential activators of cyclin Ddependent kinases in murine fibroblastsJ.EMBO J，1999;18(6):157183.3 muraoka RS,Lenferink AE,Law B,et al.ErbB2/Neuinduced，cyclinD1dependent transformation is accelerated in p27haploinsufficent mammary epithelial cell but impaired in p27n
